关博元，张正翰，石佳鑫，时 旭，岳喜庆*，杨 梅*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

乳是雌性哺乳动物分娩后从乳腺分泌的一种生物流体，含有多种功能性生物活性成分，如细胞因子、生长因子、核苷酸以及蛋白质等，在机体免疫、生长发育以及肠道微生物群落调节中发挥重要作用[1-2]。在母体分娩15 d以后所分泌的乳称为常乳，常乳分泌时间长，对哺乳婴幼儿十分重要。牛乳含有人体生长发育以及维持机体健康所需的氨基酸、矿物质、维生素以及乳蛋白和乳脂肪等营养物质，被认为是人类的理想天然食品之一[3]。

虽然牛乳的营养成分组成与人乳相近而被作为人乳替代品首选，但是牛乳和人乳的物质组成上仍然存在质与量的差异，人常乳中乳清蛋白与酪蛋白的比例为60∶40，而牛常乳中乳清蛋白与酪蛋白比例为20∶80，虽然牛乳中酪蛋白比重高于人乳，但是实验证明人乳具有高成分β-酪蛋白和低成分αS1-酪蛋白，较牛乳更为营养[4-5]。人常乳中的免疫球蛋白A、乳铁蛋白和溶菌酶占总蛋白的30%，高于牛常乳，能够有效抑制婴幼儿肠道中病原微生物的生长繁殖[6]。人乳中脂肪含量与牛乳相近，但是人乳中不饱和脂肪酸结构较牛乳更加合理，容易被婴幼儿消化吸收[7]。研究表明人乳较牛乳含有更高比例的复合低聚糖，具有免疫调节以及促进婴幼儿结肠成熟的功能[8-9]。母乳可为新生儿健康提供营养、补充肠道益生菌，但是存在无法母乳喂养的情况，所以有必要开发一种婴幼儿配方乳品，以最佳的方式模拟人乳。虽然牛初乳中营养价值高且富含免疫因子，但是物理性质不如牛常乳稳定，不适合用于婴幼儿配方乳品的生产加工，因此通过对比牛常乳与人常乳的生物活性物质，开发更适宜婴幼儿食用的配方乳品具有重要意义[10-11]。

由于人体摄取乳中蛋白质的营养取决于其中所含有的各氨基酸之间的比例情况，各氨基酸比例是否合理是婴幼儿能否获取营养的关键指标，因此人体对蛋白质的需求实际上就是对氨基酸的需要[12-13]。部分学者在人乳或牛乳中只检测到部分氨基酸[14-17]，并且也仅对牛乳和人 乳之间部分氨基酸 进行对比研究[18-19]，Liang Xiaona等[20]对人初乳和牛初乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸的种类及含量进行对比分析，研究发现虽然牛初乳中水解氨基酸总量高于人初乳，但是人初乳中游离氨基酸总量高于牛初乳且种类更齐全，该实验仅对人乳和牛乳的初乳阶段进行全谱游离氨基酸和水解氨基酸的种类及含量对比分析。因此为继续完善不同泌乳时期人乳和牛乳中氨基酸的组成与含量差异研究，本实验以人常乳和牛常乳为原料，对42 种全谱氨基酸进行分析，采用实验自动化程度、灵敏度更高的同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）结合高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）技术[21]，测定乳中全谱游离氨基酸和全谱水解氨基酸，对人常乳和牛常乳之间的氨基酸组成含量进行对比研究，为配方乳品以及功能性食品的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人常乳：实验采集自沈阳市某医院正常分娩、身体状况良好、头胎、饮食正常、年龄26～35 岁，产后30～40 d的产妇15 人，上午10点收集乳样，将其放入已消毒的采样瓶中，低温运回实验室，实验前进行混合（防止个体差异）。除当天用乳样放入4 ℃冰箱保存外，其余乳样均置于－80 ℃冰柜冷藏，乳样由授乳母亲自愿提供。

牛常乳：实验采集自沈阳市富强奶牛养殖场，选取年龄1～5 岁，体质量在700 kg左右，泌乳日龄30～40 d的健康荷斯坦奶牛15 头，上午10点收集乳样，将其放入已消毒的采样瓶中，低温运回实验室，实验前进行混合（防止个体差异）。除当天用乳样放入4 ℃冰箱保存外，其余乳样均置于－80 ℃冰柜冷藏。

甲酸、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher公司；iTRAQ®试剂盒（10%磺基水杨溶液（含有400 pmol/μL的正异亮氨酸）、标记缓冲液（含有20 pmol/μL的正缬氨酸）） 美国应用生物系统公司。

1.2 仪器与设备

U3000液相色谱系统 美国戴安公司；API3200 QTrap质谱系统 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 样品衍生化处理

移取80 μL乳样于1 mL离心管中，向离心管中加入100 μL 10%磺基水杨酸溶液（含有400 pmol/μL正异亮氨酸），涡旋振荡35 s后8 000 r/min离心5 min，吸取20 μL上层液体于另一1 mL离心管中，边涡旋边向离心管中加入50 μL标记缓冲液（含有20 pmol/μL正缬氨酸），继续涡旋15～20 s后8 000 r/min离心4 min。移取20 μL上层液体置于另一1 mL离心管。每个离心管中分别加入10 μL稀释的iTRAQ试剂后充分混匀。室温条件下静置孵化30 min后加入10 μL羟胺，涡旋振荡混匀后8 000 r/min离心5 min。加入40 μL内标物涡旋混匀后，8 000 r/min离心5 min，上样待测。

1.3.2 衍生化样品HPLC-MS/MS检测条件

H P L C条件：色谱柱为M S L a b H P-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量3 μL；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈-0.1%甲酸；流速0.8 mL/min；柱温50 ℃。梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

MS条件：电子电离源，正离子电离方式；多反应监测扫描；碰撞气为Medium；电喷雾电压5 500 V；雾化温度500 ℃；雾化气压力55 psi；辅助气压力60 psi；去簇电压35 V；射入电压10 V；碰撞能量30 eV；碰撞室射出电压5 V；气帘气压30 psi。

1.3.3 样品酸水解处理及检测

取5 mL乳样于水解管中，加入5 mL浓盐酸混匀后，用氮气吹扫瓶内几秒钟后迅速密封，置于120 ℃水解23 h左右，然后取出水解液，4 000 r/min离心5 min后取上清液，用50 μL氮气吹干后，加100 μL去离子水复溶，溶液待测。酸水解后样品衍生化处理同1.3.1节。酸水解后衍生化样品HPLC-MS/MS检测条件同1.3.2节。

1.4 数据统计

使用SPSS 17.0程序对检测得到的数据进行分析，使用Levene法对数据进行方差齐性分析。本研究测定的氨基酸质量浓度数据以 ±s表示，采用t检验进行数据显著性分析，根据P值判断差异性。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸种 类的鉴定结果

如图1所示，12 min内得到42 种全谱氨基酸和2 种质控氨基酸即正异亮氨酸（Nle）和正缬氨酸（Nva）的总离子流图。2 种质控氨基酸为非人体内氨基酸，在样品预处理步骤中引入400 pmol/μL Nle，Nle回收后浓度为399.7 pmol/μL，通过Nle回收率校准各氨基酸的检测结果。在衍生化标记步骤中引入20 pmol/μL Nva，Nva回收后浓度为15.97 pmol/μL，Nva用于检测标记反应的效率，反应效率在80%～120%为合格[22]。图1中各离子之间分离清晰，且2 种质控氨基酸回收率并无统计学差异，说明该方法可以检测样品中各氨基酸的含量。

图1 44 种氨基酸的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of 44 amino acids

2.2 人常乳与牛常乳中游离氨基酸的对比分析

2.2.1 游离必需氨基酸的对比分析

表2 人常乳与牛常乳中游离必需氨基酸检测结果Table 2 Contents of free essential amino acids in human and bovine miillkkss

由表2可知，人常乳中9 种必需氨基酸质量浓度显著高于牛常乳（P＜0.05），人常乳中His质量浓度约是牛常乳17 倍，His能够缓解由于高脂肪饮食引起的肝损伤[23]。人常 乳中的Leu、Met、Phe以及Thr质量浓度显著高于牛常乳（P＜0.05），其中Met在人体中缺少可能会诱导多发性硬化症，对中枢神经系统中的组蛋白H3以及DNA的甲基化具有潜在影响[24]；Phe可用来合成神经递质和激素参与机体的糖代谢和脂肪代谢[25]；Thr与Fe结合的Thr-Fe螯合物具有缓解和改善缺铁性贫血的功能[26]，通过牛常乳和人常乳中必需氨基酸质量浓度的差异，有助于深入了解人乳和牛乳。

2.2.2 游离非必需氨基酸的对比分析

由表3可知，人常乳中含有11 种非必需氨基酸，而牛常乳中含有7 种非必需氨基酸，人常乳中的非必需氨基酸与牛常乳相比种类更齐全。人常乳中Glu质量浓度最高，这与Ping Feng等[14]测定结果一致。人常乳与牛常乳间非必需氨基酸质量浓度均存在显著性差异（P＜0.05），除Gln外，人常乳中非必需氨基酸质量浓度均高于牛常乳。人常乳中Ser质量浓度约是牛常乳27 倍，据研究表明L-PSer在机体中通过多种生化和分子机制起到神经保护的作用，具有治疗神经系统疾病的潜力[27-28]。牛常乳中均不含有Asn、Asp、Cys以及Pro，Asn具有维持人体内细胞增殖以及蛋白质合成的作用[29]；Asp能够促进三羧酸循环，同时也与鸟氨酸循环密切相关[30]；L-PCys可为人体补充巯基，维持皮肤的代谢[31]；L-Pro与抗坏血酸2种物质会影响DNA甲基化、转录以及能量代谢[32]，人常乳较牛常乳所具有的 营养特性可能与这4 种非必需氨基酸有关。

表3 人常乳与牛常乳中游离非必需氨基酸检测结果Table 3 Contents of free non-essential amino acids in human and bovine miillkkss

表4 人常乳与牛常乳中游离非蛋白质编码氨基酸检测结果Table 4 Contents of free non-protein amino acids in human and bovine miillkkss

如表4所示，人常乳与牛常乳均含有15 种非蛋白质编码氨基酸，Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa和Hcit均未在人常乳与牛常乳中检出，人常乳与牛常乳除GABA和Ans质量浓度差异不显著外（P＞0.05），其他氨基酸质量浓度均存在显著性差异（P＜0.05）。在人常乳中Tau、Cit、Abu、Ans、1-MHis、3-MHis以及PSer质量浓度高于牛常乳，其中1-MHis是参与神经之间信号传导的神经递质[33]，Cit具有调节血压和抗氧化活性[34]，因此非蛋白质编码氨基酸可作为营养补充剂提升功能性乳制品的品质。

2.3 人常乳与牛常乳中水解氨基酸的对比分析

2.3.1 水解必需氨基酸的对比分析

表5 人常乳与牛常乳中水解必需氨基酸检测结果Table 5 Contents of hydrolytic essential amino acids in human and bovine miillkkss

从表5可知，人常乳和牛常乳除Trp外，均含有8 种必需氨基酸，且质量浓度均存在显著性差异（P＜0.05），同时牛常乳中8 种必需氨基酸质量浓度明显高于人常乳，在人常乳必需氨基酸中质量浓度最高的是Leu，与Ding Ming等[35]测定结果一致，Leu能够激活人体中雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），激活后的mTOR可调节人体细胞的生长和分裂并且促进蛋白质的合成[36-37]，根据人常乳和牛常乳氨基酸的组成差异，可进一步提升以牛乳为基础的婴幼儿配方乳品中氨基酸的生物学效价。

2.3.2 水解非必需氨基酸的对比分析

如表6所示，人常乳和牛常乳除Asn外，均含有10 种非必需氨基酸，人常乳与牛常乳中Asp和Cys质量浓度差异不显著（P＞0.05），牛常乳中其他8 种非必需氨基酸质量浓度显著高于人常乳（P＜0.05）。在人常乳非必需氨基酸中质量浓度最高的是Glu，近期研究表明Glu具有调节食欲的作用，Glu衍生物能够预防代谢紊乱、心血管疾病等[38]，通过对牛常乳的水解可进一步挖掘其中潜在的营养价值，为功能性乳制品的研究提供理论依据。

表6 人常乳与牛常乳中水解非必需氨基酸检测结果Table 6 Contents of hydrolytic non-essential amino acids in human and bovine milks

2.3.3 水解非蛋白质编码氨基酸的对比分析

表7 人常乳与牛常乳中水解非蛋白质编码氨基酸检测结果Table 7 Contents of hydrolytic non-protein amino acids in human and bovine miillkkss

从表7可知，人常乳和牛常乳均不含有Cth、Hcy、Car、Hyl、Hyp、3-MHis、PEtN、PSer、Asa和Hcit，在人常乳和牛常乳中GABA、Tau、Abu、Ans、β-Ala、β-Aib以及Etn质量浓度存在显著性差异（P＜0.05），其中人常乳Tau质量浓度显著高于牛常乳（P＜0.05），其余5 种非蛋白质编码氨基酸质量浓度无显著性差异（P＞0.05）。在人常乳非蛋白质编码氨基酸中，Tau是人体各组织中含量最多的氨基酸之一，被称为是“半必需氨基酸”，具有多效性功能，包括调节人体内渗透压、保持细胞膜稳定性、细胞内钙代谢以及神经元活性，有益于婴幼儿的生长发育[39-40]，通过人常乳和牛常乳非蛋白质编码氨基酸质量浓度差异，可为婴儿氨基酸补充的可能策略提供依据。

3 结 论

本实验采用iTRAQ与HPLC-MS/MS相结合的技术对人常乳和牛常乳中42 种全谱氨基酸进行测定，并对人常乳和牛常乳全谱游离氨基酸和水解氨基酸进行定性和定量分析，比较人常乳和牛常乳中氨基酸质量浓度差异。结果表明，在全谱游离氨基酸中，人常乳有7 种未被检出，而牛常乳有11 种未被检出，人常乳中游离氨基酸总量为0.37 g/L，约是牛常乳（0.16 g/L）的2 倍，可以看出人常乳中含有的氨基酸种类更齐全；在全谱水解氨基酸中，人常乳和牛常乳均有12 种未被检出，人常乳中水解氨基酸总量为2.5 g/L，牛常乳中水解氨基酸总量为3.3 g/L。在人常乳的游离氨基酸和水解氨基酸中，Glu质量浓度最高。将人常乳和牛常乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸测定结果进行对比分析，发现人常乳、牛常乳中水解氨基酸Trp、Gln、Tau等质量浓度均低于游离氨基酸，这主要是由于酸水解处理对氨基酸中吲哚环有破坏作用，从而造成氨基酸含量的损失；除Trp、Asn和Cys外，牛常乳中水解必需和非必需氨基酸质量浓度均高于人常乳，这与游离氨基酸的部分测定结果截然相反，由此说明牛常乳中氨基酸主要以蛋白质的形式存在。本实验通过对人常乳和牛常乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸差异分析，为未来配方乳制品以及功能性食品的发展提供研究参考依据。