郑淑丹，陈 钢*，阙发秀，万 聆，邓山鸿，简素平

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

脐橙誉为“柑橘之王”，其果肉颗粒饱满，鲜嫩多汁，浓甜芳香，营养成分丰富，适用于深加工。我国脐橙产量丰盛，但成熟期较集中、不易贮存，再加上我国脐橙加工业不发达，目前仍以鲜食和橙汁加工为主[1]，导致大量脐橙腐烂变质，造成严重浪费，限制了我国脐橙产业的发展[2]。

以脐橙果汁为原料酿造的果酒，乙醇体积分数较低，口感清爽，醇厚柔和，酒香绵长[3]。脐橙果酒充分地汲取了其原有的功能成分，如维生素、类黄酮、类胡萝卜素等，更利于人体吸收，具有降低胆固醇、延年益寿、保健养颜等功效[4-5]。另外，在果酒的发酵过程中，微生物将脐橙中的还原糖转化合成多种醇、酯、萜烯类等物质，增加了脐橙的营养价值并改善了风味，脐橙果酒的研究也越来越受到重视。有研究表明，脐橙果皮中存在的香气物质种类和含量颇为丰富[6]。因此，本研究以脐橙全果为原料，进行脐橙全果酒发酵工艺的优化，并与脐橙果汁酒进行风味物质的比较，从而为脐橙全果酒的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脐橙 江西省赣州地区信丰市；脐橙果汁酒 实验室自酿；白砂糖（食品级） 深圳安泰生物科技有限公司；葡萄酒、果酒专用酵母（SY） 安琪酵母股份有限公司；果胶酶（酶活力＞50 000 U/g） 上海源聚生物科技有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级） 长沙科迪亚实业有限公司；3-辛醇（色谱纯） 美国Sigma公司；β-环糊精（分析纯） 广州一码生物有限公司。

1.2 仪器与设备

HR1882型榨汁机 飞利浦（中国）投资有限公司；MP2002电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；WYT-J型手持糖度计 成都光学厂；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司；pH S22型数显酸度计 德国Sartorius公司；酒精计 上海精密科学仪器有限公司；VS-1300型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；微量移液器 上海热电仪器有限公司；5975-6890N气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司；二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程[7-8]

1.3.2 操作要点[7-8]

预处理：选取新鲜成熟的脐橙，清洗干净，切成小瓣，并去除种子。

榨汁：将处理好的脐橙全果进行榨汁作为发酵液。

酶解、脱苦：加入质量分数0.3%的果胶酶和0.3%的β-环糊精，45 ℃恒温水浴搅拌1 h。

调配：添加60 mg/L的偏重亚硫酸钾，用白砂糖调节发酵液含糖量至22%，用柠檬酸和碳酸氢钠调整发酵液的pH值至3.5～4.5。

酵母活化：取发酵液体积3%～8%的干酵母，加入料液比1∶20（g/mL）的糖水，于38 ℃活化1 h。

主发酵：加入活化好的酵母，放置在生化培养箱中恒温（25～29 ℃） 密封发酵8～18 d，直至残糖量低于4 g/L为止。

后发酵：主发酵完成后，采用虹吸法将果酒转移到另一发酵容器中，尽量避免酒与氧的接触，补加50 mg/L的偏重亚硫酸钾，在20 ℃密封静置15～20 d。

陈酿：将发酵后的脐橙果酒转入贮酒罐进行陈酿，于16 ℃满罐放置60～80 d，每隔25 d倒罐1 次，以分离沉渣及酒脚。

澄清、过滤：陈酿后的脐橙酒中加入1%壳聚糖-0.1%明胶对脐橙酒进行澄清处理，用量为0.6 g/L，随后进行过滤。

1.3.3 脐橙果汁酒的酿制

将脐橙果肉经过榨汁、过滤处理得到的脐橙果汁作为发酵液，其后续工艺流程和上述一致。

1.3.4 脐橙全果酒发酵条件的单因素试验设计

1.3.4.1 接种量的影响

在脐橙发酵液中分别接种3%、4%、5%、6%、7%、8%的酿酒酵母，28 ℃发酵12 d，以乙醇体积分数和残糖量为评价指标，探讨酿酒酵母接种量对脐橙全果酒发酵效果的影响。

1.3.4.2 发酵时间的影响

脐橙发酵液中酿酒酵母接种量6%，发酵温度28 ℃，分别发酵8、10、12、14、16、18 d，以乙醇体积分数和残糖量为评价指标，探讨发酵时间对脐橙全果酒发酵效果的影响。

1.3.4.3 发酵温度的影响

脐橙发酵液中果酒干酵母接种量6%，分别在25、26、27、28、29、30 ℃不同温度条件下进行发酵，发酵12 d，以乙醇体积分数和残糖量为评价指标，探讨发酵温度对脐橙全果酒发酵效果的影响。

1.3.5 响应面优化试验

通过对单因素试验结果分析，采用Box-Behnken响应面设计分析方法[9-11]，选择酵母接种量、发酵时间、发酵温度3 个因素进行响应面试验，以乙醇体积分数为响应值进行优化，所有试验均重复3 次，因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.6 理化指标测定[12]

乙醇体积分数的测定：酒精计法；糖度的测定：手持折光仪法；残糖量的测定：斐林试剂滴定法；SO2的测定：直接碘量法；pH值的测定：采用PHS22型酸度计。理化指标重复测定3 次。

1.3.7 GC-MS条件[13-14]

将固相微萃取萃取头在GC-MS仪的进样口老化，老化温度250 ℃，老化时间30 min，载气流速1.0 mL/min。取10 mL脐橙酒样于25 mL螺口进样瓶中，加入内标物3-辛醇（400 μg/L）5 μL和0.1 g/mL NaCl溶液，密封置于45 ℃水浴中平衡30 min。平衡后插入经过老化处理的固相微萃取头，顶空萃取40 min后，再将萃取头插入GC进样口，解吸5 min。

色谱条件[15-16]：色谱柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；升温程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；He流量1.0 mL/min；无分流进样；进样口温度：250 ℃；

质谱条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；电子能量70 eV；灯丝发热电流0.25 mA；扫描质量范围m/z33～450。

1.3.8 香气成分分析[17]

定性分析：运用计算机谱库（NIST/WILEY）对所得结果进行初步检索及资料分析，并结合相关文献进行定性分析。

定量分析：采用内标法，内标物为3-辛醇（400 μg/L），按下式计算：

式中：Wi为挥发性风味化合物质量浓度/（μg/L）；Ws为加入内标物质量/μg；Ai为待测组分的峰面积；As为内标物的峰面积；fi’为待测组分对内标物的质量相对校正因子。

1.3.9 感官评定

参照GB/T 10220—2012《感官分析方法学总论》要求组建感官评定小组（20 人）[18]，参考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒通用试验方法》制定评分标准，并依据该标准对脐橙果酒进行感官评分，取其平均值作为评分结果。感官评分标准见表2。

表2 脐橙酒感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of navel orange wine

2 结果与分析

2.1 脐橙全果酒发酵条件的单因素试验结果

2.1.1 酵母接种量的影响

图1 酵母接种量对果酒乙醇体积分数和残糖的影响Fig. 1 Effects of inoculum amount on ethanol production and residual sugar concentration

如图1所示，酵母接种量低于5%时，其自身繁殖代谢缓慢，果酒残糖量偏高且乙醇体积分数偏低，发酵不彻底。当酵母接种量为6%时，乙醇体积分数和残糖量分别达到最大值和最小值。由此可见，酵母接种量越大，果酒乙醇体积分数越高，糖分解转化率越高，乙醇体积分数也越高。但是，过大的接种量会使酵母自身的呼吸和繁殖加快，消耗过多的糖分，发酵液中用于生成乙醇的糖分便会相应减少。并且由于营养成分的消耗以及代谢物的生成，降低了酵母发酵环境的质量，从而导致酵母的早衰和自溶，使果酒的乙醇体积分数下降[19-20]。

2.1.2 发酵时间的影响

发酵时间短，酵母活力没有充分发挥作用而导致发酵不完全，发酵液残糖量偏高，乙醇体积分数较低。如图2所示，随着发酵时间的延长，发酵液残糖量逐渐降低，乙醇体积分数逐渐上升。发酵前8 d，残糖量下降以及乙醇体积分数增长速度均较快。发酵到第14天时，乙醇体积分数达到11.2%，残糖量降为3.7 g/L 左右，基本达到发酵终点，随后便趋于稳定状态。

图2 发酵时间对果酒乙醇体积分数和残糖的影响Fig. 2 Effects of fermentation time on ethanol production and residual sugar concentration

2.1.3 发酵温度的影响

图3 发酵温度对果酒乙醇体积分数和残糖的影响Fig. 3 Effects of fermentation temperature on ethanol production and residual sugar concentration

酵母的生长繁殖和温度密切相关，其直接影响果酒的品质。温度太低会使酵母的生长受到抑制，糖降解速率偏低，发酵时间偏长，且发酵不充分[21]。在一定的范围之内，温度越高，酵母的生长速率越快，酶活力越高，所需发酵时间相对缩短。但是，温度太高会使果酒风味物质流失，并产生不良的发酵味，从而使果酒的品质和口感下降[22]，其可能是因为高温会使发酵前期太过剧烈，以致后期发酵力不足。如图3所示，当主发酵温度为28 ℃时，发酵平稳且彻底，易于控制，果酒口感和品质较佳，所需发酵时间也适中。

2.2 脐橙全果酒发酵条件的响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果

参照单因素试验结果，选择发酵温度（A）、酵母接种量（B）、发酵时间（C）各因素的最优试验范围进行Box-Behnken试验设计，以乙醇体积分数为响应值，响应面试验结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 3 Box-Behnken design with experimental values of ethanol production

利用Design-Expert对表3的响应值进行整理分析，确立回归方程预测模型如下：

2.2.2 方差分析

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted regression model

对上述二次回归方程进行方差分析，所得结果见表4。可以看出，此模型极显著（P＜0.000 1），并能较好地反映出脐橙全果酒乙醇体积分数和各因素之间的线性关系（R2=0.983 1）；调整系数R2Adj为0.961 4，表明此模型拟合程度较好；失拟项不显著（P＞0.05），可以用此模型对脐橙全果酒进行分析预测。一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），表明这几个因素对脐橙全果酒乙醇体积分数影响较大。根据F值的大小，各因素对脐橙全果酒乙醇体积分数的影响程度为：酵母接种量＞发酵温度＞发酵时间。

2.2.3 因素间交互作用分析

图4 各因素交互作用对果酒乙醇体积分数影响的响应面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on ethanol production

从图4可知，随着各因素水平的增加，乙醇体积分数呈现先升高后降低的趋势，且B对乙醇体积分数的影响要大于A和C。另外，等高线的形状可以反映出各因素的交互作用对响应值的影响，当等高线为椭圆形时，说明其交互作用显著，而当等高线为圆形时，其交互作用则不显著[23]。由图分析可知，酵母接种量和发酵温度之间的交互因素较为显著，这和方差分析结果保持一致。

2.2.4 最佳工艺条件确定

通过Design-Expert V 8.0.6分析可以得出脐橙全果酒的最佳工艺条件为发酵温度28.28 ℃、酵母接种量6.38%、发酵时间14.40 d，此条件下发酵的脐橙全果酒乙醇体积分数为11.25%。为验证该方案的可靠性，并结合实际情况，将发酵工艺参数调整为：发酵温度28 ℃、酵母接种量6.4%、发酵时间14 d。在此条件下进行3 组平行实验，所得乙醇体积分数分别为11.2%、11.3%、11.2%，平均值为11.23%，与理论预测值仅相差0.08%，表明实验结果与该模型相符度高。因此，通过响应面分析法优化得到的脐橙全果酒发酵工艺条件准确可靠，参考性较高。

2.3 脐橙全果酒与脐橙果汁酒风味物质的分析比较

香气成分是果酒感官评定的直接影响因素，也是评价果酒品质特性的重要指标。果酒中的大部分香气成分是在发酵过程中由酵母代谢产生的，种类丰富，主要包括酯类、醇类、酸类、萜烯类等[24]。果酒中的挥发性成分种类颇丰富，且呈现出不同的香气，这些香气物质富集在一起，并相互协调，赋予了果酒浓郁而独特的风味[25-26]。此外，果酒的发酵工艺条件也会对香气的成分和含量造成一定的影响。气味活度值（odor activity value，OAV）反映了香气成分挥发性的大小及难易程度，能较客观地体现香气成分对酒风味的影响[27]。采用顶空固相微萃取并结合GC-MS技术，对两种脐橙酒中的关键风味物质进行了鉴定，在脐橙全果酒和脐橙果汁酒中分别检出25 种和11 种挥发性香气物质。通过表5分析可知，脐橙全果酒的香气活性成分主要为萜烯类，其次为醇类和酯类，而脐橙果汁酒的主要香气成分为醇类。4-松油烯醇和里哪醇是脐橙全果酒主要香气成分，而3-甲基-1-丁醇在脐橙果汁酒中含量最丰富。

表5 脐橙果酒风味物质分析Table 5 Flavor components of different navel orange wines

表6 脐橙果酒风味物质的OAV分析Table 6 OAVs of flfl avor components in different navel orange wines

比较这两种脐橙酒的各类风味物质，发现其在定性和定量上均有所不同。脐橙全果酒中共检测出9 种醇类物质，占总香气成分的28.50%。虽然脐橙果汁酒中只检测出4 种醇类物质，但其含量却高达91.95%，其中3-甲基-1-丁醇更是脐橙果汁酒香气成分的主要贡献者，赋予脐橙酒诱人的水果香和花香，并能够持久保存[28]。在脐橙全果酒中共含有9 种萜烯类化合物，且所占比例较大（66.00%），除橙花叔醇外，OAV均大于1，香气特征明显（表6）。其中，D-柠檬烯和里哪醇被视为脐橙酒的特征香气成分，嗅觉阈值低，OAV高，赋予脐橙果酒愉悦的甜香、花果香，以及独特的脐橙风味[29]。然而在脐橙果汁酒中只检测出一种萜烯类物质（香茅醇），且含量较低（0.27%），风味不突出。酯类物质含量在两种酒中均不高，且种类上也有很大的差别。癸酸乙酯和辛酸乙酯是两种酒中共同含有的酯类物质，其含量和OAV在脐橙全果酒中相对高一点，从而使脐橙全果酒的香气更浓郁。另外，醛酮类物质只在脐橙全果酒中检测到，虽然其含量较少，但对脐橙酒香气的呈现起到不可忽视的作用[30]。感官评价方面，脐橙全果酒得分（90.2 分）高于脐橙果汁酒（84.7 分），且在香气得分上有较明显的优势（脐橙全果酒为25.4 分，脐橙果汁酒为21.8 分）。综合分析看来，脐橙皮和果肉的加入使有更多的原料成分经过发酵融入酒体中，从而增加了脐橙全果酒香气的种类和含量，对感官评定也有一定的改善。

3 结 论

采用单因素试验和Box-Behnken试验设计，通过响应面分析法得到脐橙全果酒最佳发酵工艺条件：酵母接种量6.4%、发酵温度28 ℃、发酵时间14 d，在此优化条件下，脐橙全果酒的乙醇体积分数为11.23%。此工艺下酿制的脐橙全果酒酒体色泽金黄明亮，口感丰满圆润，柔和爽口，香气浓郁协调，回味绵长，风格突出。

通过顶空固相微萃取GC-MS对脐橙全果酒和脐橙果汁酒风味物质进行鉴定，在脐橙全果酒和脐橙果汁酒中分别检出25 种和11 种挥发性香气物质。脐橙全果酒的香气活性成分主要为萜烯类，占香气成分的66.00%，其次为醇类和酯类，而脐橙果汁酒的主要香气成分为醇类，所占比例为91.95%。4-松油烯醇和里哪醇是脐橙全果酒主要香气成分，而3-甲基-1-丁醇在脐橙果汁酒中含量最丰富。通过分析比较，脐橙全果酒中香气成分种类更复杂，含量更丰富。综合感官评价分析，脐橙全果酒优于脐橙果汁酒，其口感更加饱满醇厚，香气更加持久浓郁，更具有脐橙典型性风味。