郭薇丹，刘薇丛，胡作民，李正雯，付湘晋*

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

鱼肉富含不饱和脂肪酸，非常容易氧化，产生腥味及有害物质，如丙二醛、己醛、壬醛等[1]。添加抗氧化剂是抑制脂肪氧化最常用的方法。随着人们对食品品质越来越高的追求，亟需开发高效安全天然抗氧化剂代替化学合成抗氧化剂，其中食品微生物类抗氧化剂是研究热点之一[2-3]。大量报道发现某些乳酸菌、酵母菌具有优良的抗氧化活性[4-6]。Baka等[7]研究发现，乳酸菌Lactobacillus sakei 4413能有效抑制香肠中的脂肪氧化，可使硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值比对照低1 mg/kg；Zeng Xuefeng等[8]报道，乳酸菌Lactobacillus plantarum 120、酵母菌Saccharomyces cerevisiae 22可有效抑制酸鱼脂肪氧化。付湘晋等[9-10]研究发现，酵母可有效抑制鱼肉脂肪氧化，并清除脂肪氧化产物，如丙二醛、己醛、癸醛，脱除鱼肉腥味；所用酵母为面包酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母、酿酒酵母等；这些酵母的最适生长温度为20～28 ℃，而鱼肉一般采用冷藏，限制了酵母菌株在鱼肉保鲜上的应用。所以，筛选既有抗氧化活性、又有耐冷冻特性的酵母，用于水产品、肉制品保鲜，有一定实际应用前景。

耐冷冻酵母指可以进行冷冻保藏，且在冷藏、解冻后，酵母仍然具有较高的活性，发酵能力和产气能力都较好的酵母[11]。目前，筛选耐冷冻酵母用于冷冻面团加工的研究较多[12-14]，如江正强等[15]在自然界选了上百株酵母菌株，通过冷冻筛选出了耐冷冻酵母W122，在长时间的冷冻之后，其发酵力仍然有78%。但目前鲜见报道筛选既具有抗氧化活性又具有耐冷冻特性的酵母。

本研究以常见食品为分离材料，采用冻融法对耐冷冻酵母进行富集，涂布平板法和平板划线法分离、纯化耐冷冻酵母；并分析这些酵母菌株的生长特性、产气特性、抗鱼肉脂肪氧化特性，为开发新型水产品、肉制品保鲜剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株分离材料：苹果、葡萄、榨菜、面肥、豆豉、生啤酒、栀子花、酒糟等购自当地市场或自制。

培养基：察氏液体培养基，在120 ℃高压灭菌20 min。取出后冷却待用。

硫代巴比妥酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TG25KR离心机 长沙东旺实验仪器有限公司；SW-CJ-IFD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SPK-150BIII微生物培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；BlueStar B紫外-可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；G154DWS立式自动压力蒸汽灭菌锅厦口致微仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐冷冻酵母的富集

取适量面肥、苹果、葡萄、蘑菇榨菜、豆豉、啤酒、栀子花、酒糟等可发酵食品，按质量比1∶100放入超纯水中，将其置于28 ℃的恒温培养箱培养5 d，使其充分发酵富集酵母菌。之后将所得富集液进行冻融循环。每次－18 ℃冷冻12 h，28 ℃培养24 h，共冻融循环5 次[16]。冻融结束后，样品进行纯化分离得到所需酵母。

1.3.2 耐冷冻酵母的分离

耐冷冻酵母的筛选采用10 倍稀释涂布法。将涂布好的培养基放入28 ℃的恒温培养箱中培养3 d，观察已培养好的菌落，典型的酵母菌菌落表面光滑、湿润、黏调，质地柔软，易于挑起，多为乳白或奶油色，有酒香味；据此特征挑取单菌落。对于所挑取的单菌落平板划线，进行分离、纯化。重复进行3 次以上以得到纯菌落。将纯化后的酵母菌接种至试管斜面上，保存于4 ℃备用。

1.3.3 酵母生长曲线的测定

酵母菌株的活化：无菌环境下，在50 mL锥形瓶中，接种酵母菌1 环于20 mL培养液，置于28 ℃恒温培养箱中培养18 h，得到酵母的种子液。

将所得种子液吸取20 mL分装于两个500 mL三角瓶中（200 mL察氏培养基），于28 ℃培养。接种后每隔2 h取样，以未接种培养液调零，测定各样品在波长600 nm处的吸光度[17]。

1.3.4 酵母发酵力的测定

取培养18 h的种子液置于具塞试管中，放置杜氏小管，并盖紧盖子，以防漏气。将上述装有杜氏小管的具塞试管置4 ℃的冰箱中恒温培养，观察杜氏小管中产气情况。

1.3.5 酵母菌株鉴定

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。选用ITS序列，它对酵母序列有很高的敏感性和特异性[18]。

正向引物ITS1的序列：5’-TCCGTAGGTGAA C C T G C G G-3’；反向引物I T S 4的序列：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR体系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，ITS1（10 μmol/L）2 μL，ITS4（10 μmol/L） 2 μL，模板1 μL；去离子水20 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃、10 s，54 ℃、10 s，72 ℃、10 s，35 个循环；72 ℃、5 min。取2 μL PCR扩增原液点样于1%的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为TAE缓冲液，控制电压110 V，电泳40 min。

测序结果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库BLAST进行比对，得到同源性较高（99%）的基因序列。

1.3.6 酵母抗鱼肉脂肪氧化活性测定

手工采集新鲜草鱼背部白肉，加1 倍质量的蒸馏水，10 000 r/min匀浆1 min，获得鱼浆。取培养18 h的酵母菌液1 mL，加入5 g鱼浆，对照鱼肉中加1 mL蒸馏水，充分混匀；样品4 ℃放置4 h，取样，根据文献方法测定TBARS值[19]。

1.4 数据统计及图像处理

采用Excel软件进行数据统计、绘图。采用MEGA6软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 酵母的菌落形态

通过对分离材料进行培养、冻融富集后。对所得发酵液进行涂布平板法和平板划线法，分离、纯化，从而得到纯菌落。最终得到25 株酵母菌落，标记为J1～J25。将酵母菌株接种于察氏培养基上进行培养，得到纯化的酵母单菌落，并观察其形态特征。由表1可 知，酵母菌落大部分白色，有个别为红色或浅红色，且形态为微隆。大部分酵母菌落的边缘光滑透明，而菌株J4、J9、J14、J21的菌落边缘则为不透明。所有菌落都是光滑、有光泽且湿润。

表1 酵母菌落形态特征Table 1 Colonial characteristics of yeast strains

2.2 酵母的生长特性

图1 酵母菌株的生长曲线Fig. 1 Growth curves of yeast strains

由图1可知，随着培养时间的延长，菌液的吸光度随着培养时间延长而逐渐增大，趋势明显，当培养至24 h时，吸光度值趋于平稳，酵母菌开始处于稳定期。

2.3 酵母的产气特性

酵母发酵会产生气体，因此酵母的发酵能力的强弱可以通过酵母的产气能力来进行判断。杜氏管发酵法是一种直观、简便测定发酵力的方法[20]。通过对筛选所得的25 株耐冷冻菌株进行产气能力的测定，从而进一步筛选得到发酵力好的耐冷冻酵母。由表2可知，低温条件下，发酵力较好的菌株有J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J 25，这几株酵母4 ℃时24 h内即已产气，而普通酿酒酵母在12 ℃时，延迟期约2 d[21]，在4℃时基本不生长产气[22]；表明筛选到的菌株在低温下具有更好活力。

表2 酵母产气特性Table 2 Gas production characteristics of yeast strains

续表2

2.4 耐冷冻酵母的鉴定

对筛选所得的8 株发酵力较好的酵母进行测序鉴定。5.8S rDNA通过引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。测序结果采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库BLAST进行比对。依据以上8 株菌株的同源性比较结果，选取与各菌株同源性较高，且已定名菌株的信息进行系统发育分析，并构建系统进化树，如图2所示。8 株酵母菌株都属于异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomal us）。W. anomalus是一种食品中常见酵母[23-24]，如面粉饺子面团中，W. anomalus占比67.2%，米粉饺子面团中W.anomalus占比27.0%[25]，Khamir酸面团中分离到的酵母菌株均鉴定为W. anomalus[26]。

图2 依据5.8S rDNA基因序列构建8 株酵母的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of 8 yeast strains selected

2.5 耐冷冻酵母抗鱼肉脂肪氧化活性

TBARS值表征脂肪氧化二级产物含 量，特别是丙二醛含量；TBARS值与鱼肉腥味强度正相关。测定发酵力较好的菌株J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J25对冷藏（4 ℃）鱼肉T BARS值的影响，结果见图3。鱼肉冷藏4 h，TBARS值升高约50%；所有菌株均具有一定抗鱼肉脂肪氧化活性，其中菌株J15、J25可抑制TBARS值增加，菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消减TBARS。

图3 酵母对冷藏鱼肉浆TBARS值的影响Fig. 3 Effect of selected strains on TBARS value of frozen fish mince

Kakuta等[4]比较了2 250 株酵母菌株的抗氧化活性，其中抗氧化活性最高的酵母菌株AN231鉴定为Pichia ohmeri，AN231分泌的抗氧化活性物质属于酚类，具有与BHA、BHT相当的抗氧化活性。一般抗氧化剂只具有抑制脂肪氧化及脂质氧化产物累积的活性，而本研究筛选到的菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消减TBARS，其抗脂肪 氧化的机制可能不同于一般抗氧化剂。付湘晋等[9-10]通过分析酵母对鱼肉挥发性成分的影响，提出酵母醛/醇脱氢酶对醛类物质的转化是TBARS消减的重要机制。醛代谢酶，如醛脱氢酶、醛还原酶、醇脱氢酶等是细胞代谢TBARS的重要途径[27]。姚仕彬等[28]也发现酵母细胞能有效降低离体草鱼肠道黏膜细胞培养液中丙二醛浓度，同时能降低丙二醛导致的细胞内溶物漏出，提高丙二醛损伤的细胞抗氧化能力。因为TBARS（如丙二醛）可与蛋白质、核酸反应，破坏人体正常生理功能，引起“羰基应激”，与炎症、衰老、肿瘤、阿尔茨海默病等均密切相关[29]。所以，消减TBARS的菌株还具有用于功能性食品加工的前景。Konkit等[30]发现，乳酸菌L. chungangensisCAU28T的醛脱氢酶活性高，用此菌株发酵的奶酪中醛脱氢酶活性也很高，这种奶酪可显著降低实验鼠血清中致癌物质乙醛的含量。

3 结 论

以常见发酵食品为分离材料，采用冻融5 次对耐冷冻酵母进行富集，通过涂布平板法和平板划线法分离、纯化，获得25 株酵母菌；通过杜氏管法，筛选到较好的耐冷冻酵母菌株J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J25，这8 株菌均具有一定抗鱼肉脂肪氧化活性，其中菌株菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消减TBARS；通过5.8S rDNA测序、在线序列比对及发育树分析，8 株酵母菌株均鉴定为W. anomalus。本研究为开发新型水产品保鲜剂提供了参考，筛选到的菌株具有用于功能性食品加工的前景。