康 宁，王占斌，李德海*，王 銮

（东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

三萜类化合物是一种重要的中药化学成分，并且具有十分广泛的生理活性[1]。对其生物活性及毒性研究的结果显示，其在抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等多方面均显示出值得关注的药理特性[2]。三萜类化合物多来自于人参、灵芝、青钱柳、北五味子等植物中，有研究表明粗毛纤孔菌中也含有三萜类化合物[3]。

粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus (Bull.) Pat.），又名粗毛黄褐孔菌，属担子菌亚门纤毛孔菌属，是一种十分珍贵的药用真菌[4]。有研究学者认为粗毛纤孔菌是“桑黄”的一种，寄主主要有水曲柳、榆树、杨树、桑树等，西北地区以桑树上常见，东北地区以水曲柳上常见。粗毛纤孔菌在民间常用来治疗消化不良、糖尿病和胃病等疾病[5]。目前已有研究表明粗毛纤孔菌子实体中含有多种抗肿瘤和抗菌活性成分[6-7]。三萜类化合物就是其中重要的一类物质，目前获得粗毛纤孔菌三萜的方法有两种，第一是通过人工栽培子实体，采用桑枝培养基及复配栽培种培养料可较快培养出粗毛纤孔菌的子实体[8-9]，此种方法费时费力，与之相比，利用液体深层发酵技术生产粗毛纤孔菌三萜具有生产周期短、菌丝增殖速度快、三萜类含量相对稳定、不受季节影响等优点。据文献报道，深层发酵产物中三萜类化合物产量较低，使得培养成果不理想。目前通过优化碳氮源种类[10]、接种量、培养温度等发酵条件[11]、筛选菌株[12]及优化不同提取条件[13]进行研究使深层发酵三萜产量和得率得到了一定提高，但与工业化生产还有一段距离，而研究表明诱导剂能够促进生物体内代谢产物的生物合成量。

诱导剂是提高次级代谢产物的重要手段，它能改变次级代谢途径中关键酶的活性，通过快速、专一和选择性地诱导植物特定基因的表达而促进细胞合成和特定代谢产物的积累，具有较强的特异性，从而进一步达到提高次级代谢产物产量的目的[14]。目前，不少学者研究证实利用不同诱导剂增强次级代谢产物的合成远比单纯优化培养条件和工艺参数得到的效果要好得多。常用诱导剂主要有以下几种：茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），是茉莉属中素馨花中香精油的有气味化合物，也是茉莉宁特殊香味的重要成分，可作为一种内源信号分子参与到植物的防御反应，也可在植物细胞多种逆境反应中起信号介导的作用，陈林等[15]通过实验发现MeJA可显著促进茯苓三萜的生物合成，可比诱导前提高1.15 倍。水杨酸（salicylic caid，SA）是一种广泛分布于植物体内的酸类物质，它不仅参与植物许多生理过程，还与植物抗病反应密切相关，王艳等[16]研究发现SA可诱导白桦悬浮细胞三萜物质（三萜总量、齐墩果酸、白桦脂醇、白桦脂酸）的合成及相关基因的上调。不同脂肪酸在各种植物液体培养过程中起到不同作用，姚强等[17]研究发现硬脂酸和亚油酸对灵芝胞外及胞内多糖均具有良好的诱导效果，其中亚油酸对灵芝三萜的合成也具有一定促进作用。金属离子在液态深层发酵中也起着至关重要的作用，氯化锰是支持植物细胞培养中天然生物合成特性的潜在诱导剂，并且可用于持续生产有价值的次生代谢产物[18]。近年来关于粗毛纤孔菌三萜方面的研究仅局限在提取条件的优化，而对于粗毛纤孔菌三萜的合成诱导的研究报道较少。

本实验选择MeJA、SA、油酸、水曲柳煎汁、Mn2+、Fe2+、Cu2+为诱导剂，研究其对发酵过程中菌丝体量及三萜类化合物合成的动态变化，确定诱导剂最佳浓度及诱导时间，最终建立并优化诱导剂促进粗毛纤孔菌中三萜类化合物积累的诱导培养体系，提高粗毛纤孔菌三萜类化合物的合成量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗毛纤孔菌IH-69由东北林业大学森林保护实验室分离保存。

MeJA、SA、白桦脂醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、香草醛美国Sigma公司；油酸 阿拉丁试剂有限公司；MnSO4、FeSO4·7H2O、CuSO4、无水乙醇、盐酸及其他试剂均为国产分析纯。

PDA培养基：用蒸馏水润洗锅壁，加入200 g土豆（1～2 cm小块），再加入1 000 mL蒸馏水煮沸20 min，8 层纱布过滤得到土豆汁，将20 g葡萄糖与土豆汁一同放入锅中加热（固体培养基再加入10 g琼脂），直至葡萄糖完全溶解，最后定容至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SW-CMD超净工作台 苏州苏洁净化设备公司；ZPQ-400智能气候培养箱 哈尔滨市东明医疗仪器厂；TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂；722s紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂；DK-8D电热恒温水槽 上海森信实验仪器有限责任公司；RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；0.2 μm和0.45 μm滤膜 美国密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及培养

将4 ℃保存的斜面菌种接种于PDA平板上，28 ℃培养活化10 d，截取3 片直径为12 mm的菌丝片接种于PDA液体培养基中。将活化后的菌种在无菌环境下使用匀浆机打碎，再以体积分数8%的接种量接种于PDA液体培养基中，于pH 7、26 ℃、125 r/min条件下振荡培养10 d。

1.3.2 菌丝体干质量的测定

发酵结束后将培养液经纱布过滤得菌丝体，蒸馏水洗涤数次后在42 ℃的烘箱中烘干至质量恒定，精确称量菌丝体干质量。

1.3.3 粗毛纤孔菌三萜的提取和测定

将质量恒定的菌丝体粉碎，过60 目筛，按料液比1∶69（g/mL）加入72%乙醇溶液，210 W功率条件下超声辅助提取31 min[19]，离心所得上清液为粗提液，－20 ℃贮藏备用。

采用香草醛-冰醋酸比色法计算三萜类物质含量。根据文献[20]，略作修改。准确称取白桦脂醇标准品5 mg，溶于50 mL无水乙醇，混合均匀得标准溶液（100 μg/mL）。吸取标准溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分别置于5 mL容量瓶中，在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.80 mL高氯酸摇匀，于70 ℃水浴保温反应15 min后流水冷却至室温，再加入乙酸乙酯定量到5 mL，摇匀，同时做试剂空白。在551 nm波长处以试剂空白为参比，用1 cm比色皿测定体系OD值。以白桦脂醇的质量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.006 1X+0.031 4（R2=0.999 7）。

准确吸取0.2 mL上述粗提液，按标准曲线的制备方法测定OD值，按式（1）计算三萜类化合物含量：

式中：Y为OD值；N为粗提液的稀释倍数；m为粗毛纤孔菌菌丝体质量/g。

1.3.4 粗毛纤孔菌菌丝体中三萜总量的测定

粗毛纤孔菌菌丝体中三萜总量即一批发酵培养液中所获得的所有粗毛纤孔菌菌丝体中三萜类化合物的总量，计算如式（2）所示：

1.3.5 诱导剂添加量及添加时间的筛选

1.3.5.1 MeJA诱导三萜合成

准确称取MeJA，将其用无菌水配制成浓度分别为50、100 μmol/L和150 μmol/L的溶液，向其加入质量分数0.2%的助溶剂（吐温-20或吐温-80），后摇匀，经0.2 μm的滤膜过滤，分别在发酵第0、3、6天将MeJA溶液添加到PDA培养基中，添加量为2 μL/mL，并以不加助溶剂及MeJA和仅加助溶剂的培养基为空白组和对照组，以1.3.1节培养条件进行发酵，发酵结束后测定菌丝体干质量及粗毛纤孔菌三萜含量。

1.3.5.2 SA诱导三萜合成

配制2 mg/mL SA作为母液，经0.45 μm滤膜过滤。分别在发酵第0、3、6天添加不同量母液，使SA终质量浓度为20、50、100、150、200 mg/L，同时以加入无菌水的培养基作为对照组。以1.3.1节培养条件进行发酵，发酵结束后测定菌丝体干质量及粗毛纤孔菌三萜含量。

1.3.5.3 油酸诱导三萜生物合成

分别在发酵第0、3、6天添加不同体积分数（1%、2%、3%、4%、5%）的油酸，同时进行不添加油酸的对照实验，筛选油酸最佳添加时间与添加量。以1.3.1节培养条件进行发酵，发酵结束后测定菌丝体干质量及粗毛纤孔菌三萜含量。

1.3.5.4 水曲柳煎汁诱导三萜生物合成

取水曲柳条，以1∶3（g/mL）的料液比加入蒸馏水煮沸30 min后，取汤汁，经过滤后真空浓缩，60 ℃干燥至质量恒定，得水提物干粉。分别在发酵第0、3、6天向PDA培养基中添加水提物干粉，使其终质量浓度达到100、200、300、400、500 mg/L，以1.3.1节培养条件进行发酵，发酵结束后测定菌丝体干质量及粗毛纤孔菌三萜含量。

1.3.5.5 金属离子Mn2+、Fe2+、Cu2+诱导三萜合成

准确称取MnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4，用蒸馏水分别配制成不同浓度，在121 ℃灭菌30 min后在发酵第0、3、6天加入到PDA培养基中，使MnSO4和FeSO4·7H2O的终浓度为2、4、6、8、10 μmol/L；CuSO4的终浓度为50、100、150、200、250 μmol/L，以1.3.1节培养条件进行发酵，发酵结束后测定菌丝体干质量及粗毛纤孔菌三萜含量。

1.3.6 抗氧化活性的测定

将不同诱导剂诱导培养后的粗毛纤孔菌菌丝体经1.3.4节所述方法进行提取，提取液经浓缩、冷冻干燥后得到样品备用。

1.3.6.1 总还原能力的测定

参照Benzie等[21]的方法，准确移取不同质量浓度梯度的样品溶液1.0 mL，随即快速加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液。将混合溶液置于50 ℃的恒温水浴锅中保温20 min。取出后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，若产生浑浊，则将混合物在室温下3 500 r/min离心10 min吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水；若无浑浊则直接加2.5 mL蒸馏水，最后加入0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混匀后反应10 min。在700 nm波长处测得反应物的吸光度，空白以蒸馏水代替样液。以VC作为阳性对照，研究粗毛纤孔菌的总还原能力，计算如式（3）所示：

式中：A0为空白组的吸光度；A1为样液的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照Ozgen等[22]的方法，分别吸取不同浓度的样品溶液2 mL，加入1×10－4mol/L DPPH溶液2 mL后充分摇匀，于室温暗处放置30 min，517 nm波长测其吸光度A1；同时测定2 mL无水乙醇和2 mL 1×10－4mol/L DPPH混合液的吸光度A0；再测定2 mL样液和2 mL无水乙醇混合液的吸光度A2。DPPH自由基清除率计算如式（4）所示：

1.3.6.3 羟自由基清除能力的测定

参照文献[23]，在试管中依次加入10 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL，样品液1.0 mL，10 mmol/L双氧水溶液2.0 mL，摇匀后静置10 min，再加入10 mmol/L SA溶液1.0 mL，摇匀后于37 ℃水浴30 min，冷却后4 000 r/min离心10 min，在510 nm波长处测定吸光度记为A1；以蒸馏水代替样液，其他操作不变，测得吸光度记为A0；以无水乙醇代替SA溶液，其他操作不变，测得吸光度即为A2。羟自由基清除率计算如式（5）所示：

1.3.6.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定

按照Marklund等[24]的方法测定粗毛纤孔菌醇提物的超氧阴离子自由基清除率，分别吸取1.0 mL样液于试管中，加入4.0 mL pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液，摇匀后25 ℃水浴20 min，然后加入1.0 mL的60 mmol/L邻苯三酚溶液摇匀并计时5 min，5 min后加入100 μL HCl溶液终止反应，于420 nm波长处测定吸光度记为A1；以蒸馏水代替样液，其他操作不变，测得吸光度记为A0；蒸馏水代替邻苯三酚溶液，其他操作不变，测得吸光度记为A2。超氧阴离子自由基清除率计算如式（6）所示：

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 诱导剂筛选结果

2.1.1 MeJA诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

MeJA是一种信号分子，能诱导许多植物生长及次级代谢产物的合成，因此本实验研究不同浓度的MeJA在吐温-80或吐温-20助溶下对粗毛纤孔菌生长及三萜类化合物合成的影响，结果如表1所示。

从表1可以看出，MeJA加入时间、MeJA浓度和吐温助剂的种类均对粗毛纤孔菌菌丝体的生长及三萜类化合物的合成具有显著影响。随着MeJA加入时间的延长，除加入吐温-80和吐温-20且MeJA浓度为150 μmol/L培养组的三萜含量变化不显著外，其余培养组的粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量均呈增加趋势，可见在培养后期加入MeJA诱导剂有利于粗毛纤孔菌的生长和三萜的代谢合成，此结果与西洋参毛状根发酵培养后期加入诱导剂有利于人参皂苷生物合成的结果一致[25]。但是随着MeJA浓度增加，由于MeJA加入时间不同粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量变化趋势亦不相同，在第0天加入100 μmol/L MeJA的培养组显著高于其他培养组（P＜0.05），而随着MeJA加入时间延长至第6天时，加入50 μmol/L MeJA的培养组显著高于其他培养组（P＜0.05），因此可以看出，在发酵后期添加MeJA时，其浓度的增加不利于粗毛纤孔菌生长及三萜的合成。此外，从表1还可以看出，随着MeJA加入时间的延长，吐温-20培养组的粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量增加量显著高于吐温-80培养组，其中加入吐温-80且MeJA浓度为50 μmol/L组从第0天加入MeJA到第6天加入MeJA，粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量分别增加15.57%、10.27%、27.43%，而加入吐温-20且MeJA浓度为50 μmol/L组从第0天加入MeJA到第6天加入MeJA，粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量分别增加量28.94%、14.28%、47.36%，且第6天加入以吐温-20为助溶剂的50 μmol/L的MeJA培养组与比空白对照组相比三萜总量提高了48.95%。可见MeJA诱导剂能够有效促进粗毛纤孔菌菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量的增加。而研究表明，MeJA能够显著促进鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶 、氧化鲨烯环化酶、达玛烷二醇合成酶、β-香树脂合成酶基因的相对表达量，而这些酶都是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶[26]。因此后续实验研究中进一步揭示MeJA对粗毛纤孔菌三萜合成途径中哪种关键酶具有诱导表达作用。

表1 MeJA对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 1 Effects of MeJA on mycelial volume and triterpenoids of I. hispidus

2.1.2 SA诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

SA是一种广泛分布于植物体内的酸类物质，它不仅参与植物许多生理过程，还与植物抗病反应密切相关。SA对粗毛纤孔菌的诱导结果如表2所示。

由表2可知，在不同SA添加时间，粗毛纤孔菌的菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总产量均随着SA质量浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当SA质量浓度达到100 mg/L时，3 个指标值均最大（P＜0.05）。而在不同SA质量浓度条件下，随着SA添加时间的延长，粗毛纤孔菌的菌丝体量呈现增加趋势，但是不显著（P＞0.05），而粗毛纤孔菌菌丝体中三萜含量及三萜总量出现显著下降趋势（P＜0.05），这种现象说明SA可以促进粗毛纤孔菌发酵过程中菌丝体的生长，同时在发酵前期能够参与诱导三萜类化合物的合成，而在发酵后期却不利于粗毛纤孔菌三萜类化合物的合成，这与MeJA在粗毛纤孔菌发酵后期有利于诱导三萜类化合物合成的结果相反。目前关于SA诱导三萜类化合物机制研究表明，SA可提高苯丙氨酸裂解酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，经过酶促反应可生成H2O2，激活抗病途径中的防御相关基因，进而刺激次生代谢物三萜的合成和积累[27]。通过本实验的结果综合分析表明，第0天添加100 mg/L SA诱导粗毛纤孔菌三萜类化合物效果最好，在此条件下三萜总量为313.518 mg/L，与对照组相比提高了96.88%。

2.1.3 油酸诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

油酸作为一种单不饱和脂肪酸，存在于动植物体内，具有食用安全性，不仅可诱导刺激代谢产物合成，而且价格低廉，是一个良好的选择。运用油酸对粗毛纤孔菌三萜进行诱导结果见表3。

表2 SA对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 2 Effects of SA on mycelial biomass yield and triterpenoid production

表3 油酸对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 3 Effects of oleic acid on mycelial biomass yield and triterpenoids production

根据表3可知，随着添加油酸体积分数的增加，粗毛纤孔菌的菌丝体量、菌丝体中三萜含量及三萜总量均呈现先升高后下降趋势，当添加油酸量达到3%时，3 个指标均为最大（P＜0.05），而后随着油酸体积分数的增加菌丝体量及三萜含量逐渐下降，尤其加入高体积分数油酸（4%、5%）后，菌丝体量显著低于对照组，这可能是由于过大浓度的油酸覆盖在培养基的表面，减少了可溶性氧，从而抑制了菌丝体的正常生长[28]。而在不同油酸体积分数条件下，随着油酸添加时间的延长，油酸对粗毛纤孔菌菌丝体及三萜的诱导合成效果显著下降（P＜0.05），当加入时间延长至第6天时，仅2%、3%油酸具有诱导效果，可以推断油酸诱导粗毛纤孔菌三萜的合成主要发生在菌丝体的生长前期。有研究发现，油酸可使SQS和CYP51这两个三萜生物合成途径中的关键酶基因表达量上调，从而使菌丝体胞内三萜产量大幅度提高，另外油酸可抑制14α-LDM酶基因的表达，从而抑制麦角甾醇这一生成途径，间接提高三萜产量[29]。由此推测油酸是通过调节三萜合成途径中关键酶的表达量，进而促进三萜类化合物的生物合成。综上，在第0天添加3%油酸诱导粗毛纤孔菌三萜类化合物效果最好，在此条件下三萜总量为402.870 mg/L，与对照组相比提高了143.74%。

2.1.4 水曲柳煎汁诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

真菌在自然生长环境中，需要从寄主组织中汲取特殊营养物质，因此本实验将粗毛纤孔菌的寄主植物水曲柳枝条的煎汁作为诱导剂，研究其对粗毛纤孔菌三萜的影响，结果见表4。

由表4可知，第0天时，加入不同质量浓度水曲柳煎汁对粗毛纤孔菌的菌丝体量没有显著影响（P＞0.05），当质量浓度达到500 mg/L抑制了菌丝体的生长，但随着添加时间的延长，菌丝体量逐渐提高，当在第6天添加200～400 mg/L水曲柳煎汁时，实验组与对照组相比，粗毛纤孔菌的菌丝体量有显著提高（P＜0.05），尤其当添加水曲柳煎汁质量浓度为300 mg/L时，菌丝体量达到最大值（6.397±0.020）g/L，与对照组相比提高了24.58%。随着加入不同质量浓度水曲柳煎汁时间的延长，粗毛纤孔菌菌丝体中三萜含量显著提高（P＜0.05），但仅在第6天加入300～400 mg/L水曲柳煎汁时，实验组三萜含量显著高于对照组（P＜0.05），且在质量浓度为300 mg/L时，三萜含量达到最大值（36.753±0.870）mg/g，高于对照组14.52%。可见在发酵后期加入水曲柳煎汁可以诱导粗毛纤孔菌菌丝体的生长及三萜类化合物的合成，经过实验结果表明，在发酵第6天加入300 mg/L水曲柳煎汁可得最大量粗毛纤孔菌三萜，为235.109 mg/L，与对照组相比提高了42.67%。由于目前对于水曲柳煎汁中所含物质尚不明确，因此后续实验研究中进一步揭示其如何对粗毛纤孔菌三萜进行诱导。

2.1.5 金属离子诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成2.1.5.1 Mn2+诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

Mn元素在液体深层发酵中参与过氧化物歧化酶的活动，也是磷酸烯醇式脱羧酶、柠檬酸合成酶的辅助因子[30]。所以选择Mn2+对粗毛纤孔菌进行诱导培养，由表5可以发现，随着Mn2+浓度的升高，粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜含量均呈现先上升后下降趋势，且均在4 μmol/L浓度条件下达到最大值，可知4 μmol/L浓度的Mn2+对粗毛纤孔菌菌丝体及菌丝体中三萜有较好的诱导作用。但不同的添加时间对粗毛纤孔菌的影响也存在差异；第3天加入4 μmol/L Mn2+的菌丝体量及三萜含量显著高于第0、6天（P＜0.05），因此选择此条件为最佳诱导条件，可得菌丝体量（5.967±0.010）g/L、三萜含量（36.963±0.111）mg/g、三萜总量220.558 mg/L，分别于对照组相比提高了16.67%、16.02%、35.36%。

表4 水曲柳煎汁对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 4 Effects of willow branch decoction on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表5 Mn2＋对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 5 Effects of Mn2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表6 Fe2＋对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 6 Effect of Fe2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表7 Cu2＋对粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜量的影响Table 7 Effects of Cu2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

2.1.5.2 Fe2+诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成

由表6可知，Fe2+对粗毛纤孔菌菌丝体内三萜类化合物的合成没有显著诱导作用，甚至在10 μmol/L浓度下抑制了三萜类化合物的合成。但对于粗毛纤孔菌的菌丝体生长有一定促进作用，随着Fe2+浓度的增加，菌丝体量呈现先升高后降低的趋势，当添加4～6 μmol/L Fe2+时菌丝体量有显著提高（P＜0.05），超过8 μmol/L时又会显著降低（P＜0.05），说明仅在一定浓度范围内的Fe2+会促进菌丝体的生长[31]。而随着Fe2+添加时间的延长，这种诱导效果逐渐降低，在第6天添加4～6 μmol/L Fe2+对粗毛纤孔菌菌丝体并无显著提高。综上所述，在第0天添加6 μmol/L的Fe2+可最大程度促进菌丝体的生长，从而提高三萜总量，达到191.271 mg/L，较对照组提高了15.25%。

2.1.5.3 Cu2+诱导粗毛纤孔菌三萜生物合成的研究

由表7可知，随着添加Cu2+浓度的提高，粗毛纤孔菌菌丝体量及三萜含量呈现先上升后下降趋势，仅在第3、6天添加50 μmol/L和100 μmol/L Cu2+时菌丝体量有显著提高（P＜0.05）。但不同浓度Cu2+对于粗毛纤孔菌菌丝体中三萜均有显著的诱导效果（P＜0.05），且100 μmol/L Cu2+实验组显著高于其他浓度实验组。而且随着添加Cu2+时间的延长，三萜含量也有显著变化，根据实验数据可以发现，第3天添加Cu2+所得三萜含量显著高于第0、6天添加Cu2+所得。综上，在第3天添加100 μmol/L Cu2+可得最大粗毛纤孔菌三萜总量231.714 mg/L，与对照组相比提高了42.56%。有研究发现Cu2+可能诱导细胞形态发生变化，从而引起生理变化，最终影响三萜类化合物的合成[32]。

2.2 抗氧化活性分析

已有大量研究表明三萜类化合物具有较好的抗氧化活性，因此为考察粗毛纤孔菌丝体三萜类化合物的抗氧化能力，同时分析不同诱导剂对粗毛纤孔菌菌丝体合成的三萜类化合物抗氧化能力的影响，本实验测定了粗毛纤孔菌菌丝体三萜类化合物的总还原力、DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力等指标，并以VC为对照，结果如图1所示。

图1 不同诱导剂对粗毛纤孔菌三萜类化合物的抗氧化能力影响Fig. 1 Effect of different inducers on antioxidant capacity of triterpenoids from I. hispidus

从图1可以看出，粗毛纤孔菌菌丝体三萜类化合物具有很好的体外抗氧化能力，并且与三萜类化合物浓度呈正相关。此外诱导剂能够提高粗毛纤孔菌三萜类化合物的抗氧化能力，但不同诱导剂对粗毛纤孔菌三萜类化合物的抗氧化能力的影响存在差异。图1A结果表明，油酸诱导的粗毛纤孔菌三萜类化合物总还原能力最大，在质量浓度为3 mg/mL其值为1.342，是VC的1.10 倍，与未诱导粗毛纤孔菌三萜相比提高了79.48%。图1B结果表明，当质量浓度达到0.75、1.5 mg/mL和3 mg/mL时，7 种诱导剂诱导下的粗毛纤孔菌三萜类化合物以及VC对DPPH自由基清除能力最大，且3 个质量浓度下差异不显著（P＞0.05），但是都显著高于未诱导的三萜类化合物，其中油酸诱导的三萜类化合物对DPPH自由基的IC50值为0.099 mg/mL，与VC的DPPH自由基清除力最为接近，与未诱导粗毛纤孔菌三萜相比DPPH自由基清除率提高了66.71%。图1C结果表明，油酸诱导的粗毛纤孔菌三萜类化合物对羟自由基清除能力均高于未诱导和其他6 种诱导剂诱导的粗毛纤孔菌三萜类化合物对羟自由基清除能力，但是显著低于VC，油酸诱导的粗毛纤孔菌三萜类化合物对羟自由基清除能力的IC50值为1.294 mg/mL，与未诱导粗毛纤孔菌三萜相比羟自由基清除率提高了28.10%。图1D结果表明，由MeJA和油酸诱导的粗毛纤孔菌三萜类化合物对超氧阴离子自由基清除能力的IC50值分别为0.004 mg/mL和0.001 mg/mL，与VC相比差异性不显著，但是显著高于其他诱导剂，与未诱导粗毛纤孔菌三萜相比超氧阴离子自由基清除率提高了29.22%。从抗氧化结果分析可以看出，经过油酸和MeJA诱导能够提高粗毛纤孔菌三萜类化合物的抗氧化能力，说明经过不同诱导剂诱导合成的三萜类化合物成分不同，经过诱导剂诱导后三萜类化合物抗氧化能力提高，说明可能增加了有利于抗氧化的三萜类成分或诱导合成了更多具有抗氧化能力的官能团，可以进一步通过对不同诱导剂诱导合成的粗毛纤孔菌三萜类化合物的成分析实验中进行验证。

3 结 论

本实验表明，MeJA、SA、油酸、水曲柳煎汁、Mn2+、Fe2+和Cu2+7 种诱导剂均能提高粗毛纤孔菌菌丝体产量及三萜含量，其中在第0天添加3%油酸可得到最佳诱导效果，即402.870 mg（1 L培养液）的粗毛纤孔菌三萜类化合物，较对照组提高了143.74%。抗氧化能力实验表明，7 种诱导剂均能提高粗毛纤孔菌三萜类化合物的抗氧化能力，其中油酸效果最显著，其次是MeJA和SA。但关于诱导剂能够提高粗毛纤孔菌三萜类化合物产量及抗氧化能力的机理尚不明确，还需要进一步实验研究。本研究为提高粗毛纤孔菌三萜类化合物的产量以及开发新的抗氧化剂资源提供科学理论依据。