董玉玮，周 洁，苗敬芝，李 文，胡传银

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州天马敬安食品有限公司，江苏 徐州 221636）

牛蒡（Arctium lappa L.）俗称东洋参，为菊科两年生草本植物，主要分布于北欧、西伯利亚和中国东北地区，我国江苏徐州和山东地区种植历史最为悠久。牛蒡的根茎粗大肥硕，含有丰富的粗纤维，含量位居地下根茎类蔬菜中之首，同时富含蛋白质[1]、多糖[2]、纤维素[3]、黄酮苷[4]等营养成分，是药食两用健康食品，已在新型、功能型深加工产品、制药、保健品等方面形成了较多研究成果[5-7]。

长势好、品质佳的牛蒡一般作为出口、生产深加工产品的原料，但也有部分品质较低的牛蒡被丢弃，无法再利用，造成浪费和生产企业的损失。导致这一现象的主要原因是牛蒡本身，以及作为废弃物的牛蒡根皮、叶等，由于含有大量纤维素，难以再利用。提高低品质牛蒡的利用效率，最大化挖掘并提升牛蒡废弃物的价值，将有利于提高企业生产效益。微生物尤其是一些药食真菌，比如营养、保健价值较高的灵芝、猴头菇、金针菇等，具有分解、利用纤维素的能力[8]，同时牛蒡根中含有的蛋白质、维生素、矿物质等营养成分[2]也可作为药食真菌生长的原料，如果以牛蒡作为营养基质固体发酵药食真菌，则提高了牛蒡、药食真菌的利用价值，对促进牛蒡产业的可持续发展具有重要的现实意义。

真菌中的灵芝是一种药食同源的健康滋补食品，分类隶属于担子菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属，富含萜类、糖类、蛋白质以及多种氨基酸，其中多糖和三萜类含量是衡量灵芝品质的重要标准，在抗炎[9]、抗氧化[10]、抗肿瘤[11-12]、降血糖[13]等方面功效突出。固体发酵灵芝一般以木屑、棉籽壳、麦麸、石膏等作为培养基，如能采用低品质牛蒡固体发酵灵芝，将大大提高牛蒡的利用率，同时节约灵芝固体发酵的成本，有利于牛蒡、灵芝的合理利用以及精深加工产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种灵芝购自徐州市铜山县食用菌科技开发服务中心，经本实验室鉴定为多孔菌科灵芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr.) Karst）。经诱变选育后，具有高产多糖的性能，保存于本实验室；牛蒡由徐州天马敬安食品有限公司提供，品质低于出口标准。

固体发酵培养基：牛蒡洗净，去皮后切成小块，粉碎机粉碎过筛后，按比例加水配制。

乙腈（色谱纯）、单糖标准品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖） 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、琼脂粉、三氟乙酸、乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等菌种培养、多糖提取和纯化所用试剂（均为分析纯） 南京晚晴化玻仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

FA21040电子天平 北京精密仪器公司；IXQ-SG46-280A手提式压力蒸汽灭菌锅 德州市新恩精密粮仪有限公司：FSD-101A电动粉碎机 上海博讯有限公司；250D恒温光照培养箱 常州国华电器有限公司；GZ202-2电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司；DL-5低速大容量离心机 上海安亭仪器厂；7230G可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司；1260液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灵芝菌种的活化

马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB 4789.15—2010《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数》配制，用于菌种的活化及保存。

菌种活化：取灵芝菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化1～2 次。

1.3.2 单因素试验

采用牛蒡固体发酵培养基发酵灵芝，考察液固比、装瓶量、粉碎程度对固体发酵灵芝菌丝多糖含量的影响，每组实验重复3 次取平均值。

1.3.2.1 液固比的选择

粉碎后的牛蒡过8 目筛后，以0.2 g/mL装瓶量（每毫升培养瓶加入牛蒡质量）将牛蒡装入100 mL培养瓶中，按照液固比（每克牛蒡加入蒸馏水体积）为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/g配制固体培养基，无菌接种，封口膜封口，黑暗条件下28 ℃固体发酵培养15～25 d至菌丝长满培养基，将菌质于50 ℃烘干后粉碎，过60 目筛。

1.3.2.2 装瓶量的选择

粉碎后的牛蒡过8 目筛后，按照0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/mL的装瓶量，在100 mL培养瓶中装入牛蒡，以液固比0.6 mL/g配制固体培养基，无菌接种，封口膜封口，黑暗条件下28 ℃固体发酵培养15～25 d至菌丝长满培养基，将菌质于50 ℃烘干后粉碎，过60 目筛。

1.3.2.3 粉碎程度的选择

粉碎后的牛蒡分别过4、6、8、10、12 目筛，以0.2 g/mL装瓶量将牛蒡装入100 mL培养瓶中，以液固比0.6 mL/g配制固体培养基，无菌接种，封口膜封口，黑暗条件下28 ℃固体发酵培养15～25 d至菌丝长满培养基，将菌质于50 ℃烘干后粉碎，过60 目筛。

1.3.3 牛蒡固体发酵灵芝响应面工艺优化

根据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 8.06试验设计软件对牛蒡固体发酵灵芝工艺进行优化，设计3因素3水平响应面试验，因素和水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.4 菌丝多糖的提取与检测

提取多糖使用水提醇沉法：将灵芝菌丝烘干粉碎，称5 g于烧杯中，加入50 mL水混匀，60 ℃水浴1.5 h，4 000 r/min离心5 min，过滤取沉淀，重复提取3 次，合并提取液，置于60 ℃烘箱中浓缩至原体积1/5，浓缩液加入5 倍体积95%乙醇溶液，溶解过夜。4 000 r/min离心10 min，过滤取沉淀为粗多糖，60 ℃烘箱烘干，加入10～50 mL水充分溶解。测定多糖含量采用苯酚-硫酸法，根据标准曲线计算每克干菌丝中粗多糖的含量。

1.3.5 粗多糖的纯化

1.3.5.1 脱蛋白、透析

采用Sevag法对粗多糖进行脱蛋白处理。按氯仿-正丁醇体积比4∶1配制Sevag试剂，粗多糖溶液置于分液漏斗中，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，振荡20 min，4 000 r/min离心10 min得上清液，继续重复上次操作，直至氯仿层与正丁醇层之间没有乳白色变性蛋白质析出为止，合并上清液，倒入截流相对分子质量为6 000～8 000的半透膜袋中，蒸馏水透析48 h，期间每2 h更换一次水。

1.3.5.2 脱色

取透析后的多糖配制成5 mg/mL的溶液50 mL，加入30% H2O21 mL，50 ℃保温脱色3 h，直至色值不再降低，浓缩后冻干得多糖纯品。

1.3.6 红外光谱分析

将纯化后的多糖，与KBr粉末混合，置于玛瑙研钵中，研磨均匀，经压片机压片后，红外光谱上机扫描，波数4 000～400 cm－1，分辨率位8 cm－1，扫描次数64。采用Omnic 8.2分析软件采集红外光谱图。

1.3.7 单糖组成分析

1.3.7.1 酸水解

称取冻干的多糖样品2 mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 ℃条件下水解120 min。氮吹仪吹干。

标准品处理：配制10 mg/mL单糖标准品，放置于－20 ℃。用时取出融化，在密封的玻璃管中加入上述单糖标准品各5 μL，混匀。再加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，与样品同时在120 ℃条件下水解120 min。空气泵吹干。

1.3.7.2 PMP衍生化

向水解干燥后得到的单糖样品中加入溶于无水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）试剂和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混匀后，水浴70 ℃反应30 min。冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL，充分混匀。加入0.5 mL氯仿，充分振荡萃取，5 000 r/min离心5 min去除氯仿层，共萃取3 次。0.22 μm滤膜过滤后，待上机。

1.3.7.3 高效液相色谱分析

色谱柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液-乙腈（82∶18，V/V）；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL，波长245 nm。

1.3.8 菌质多糖抗氧化活性测定

1.3.8.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基能力的测定[14]

对DPPH自由基清除率进行测定，空白对照用蒸馏水代替样品，以VC作为阳性对照。DPPH自由基清除率计算如式（1）所示：

式中：Ac为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。

1.3.8.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定[15]

采用邻苯三酚自氧化法进行测定，空白对照用蒸馏水代替样品，以VC作为阳性对照，采用式（1）计算清除率。

1.3.8.3 清除羟自由基能力的测定[16]

采用邻二氮菲比色法进行测定，空白对照用蒸馏水代替样品，以VC作为阳性对照。羟自由基清除率计算如式（2）所示：

式中：A1为样品组的吸光度；A2为样品参比的吸光度；A3为损伤管的吸光度；A4为未损伤管的吸光度；A0为空白对照组的吸光度。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液固比的选择

图1 液固比对牛蒡发酵灵芝工艺的影响Fig. 1 Effect of liquid-to-solid ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由图1可知，菌丝多糖含量在液固比0～0.8 mL/g范围内先增加后减少，在液固比为0.4 mL/g时多糖含量达到最高，为24.21 mg/g。

2.1.2 装瓶量的选择

图2 装瓶量对牛蒡发酵灵芝工艺的影响Fig. 2 Effect of medium-to-culture fl ask ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由图2可知，菌丝多糖含量在装瓶量0.1～0.3 g/mL范围内先增加后减少，在装瓶量为0.2 g/mL时多糖含量达到最高，为24.33 mg/g。

2.1.3 粉碎程度的选择

图3 粉碎程度对牛蒡发酵灵芝工艺的影响Fig. 3 Effects of degree of comminution on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由图3可知，菌丝多糖含量在牛蒡粉碎后过4～12 目筛范围内先增加后减少，当粉碎后过8 目筛，多糖含量达到最高，为23.05 mg/g。

2.2 响应面试验设计结果

根据响应面试验制定详细的分析方案，试验设计与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design with predicted and observed results for response surface analysis

2.3 回归模型的建立和检验

对液固比（X1）、装瓶量（X2）和粉碎程度（X3）3 个单因素进行回归拟合，得出多糖含量（Y）回归方程：

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

经响应面软件分析，预测模型标准偏差为0.19，平均值22.68，变异系数0.83，预测残差平方和3.05，如表3所示，此模型的拟合程度较好，决定系数R2为0.993 9，P＜0.01，为极显著水平，说明该方程与实际情况相符，具有可靠性。失拟项P值大于0.05，不显著。液固比、装瓶量、粉碎程度的P值都小于0.01，对多糖含量都有极显著影响。液固比和装瓶量两两交互作用对多糖含量的影响不显著，液固比和粉碎程度、装瓶量和粉碎程度两两交互作用对多糖含量有显著影响。

2.4 响应面分析

图4 各因素交互作用响应面和等高线图Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors

由图4可知，交互影响作用大小排序为：液固比与粉碎程度＞装瓶量与粉碎程度＞液固比与装瓶量。3因素对多糖含量的影响大小依次为：粉碎程度＞装瓶量＞液固比。回归模型确定的最佳发酵工艺为液固比0.39 mL/g、装瓶量0.19 g/mL、粉碎程度6 目，预测得到的多糖含量最高为24.93 mg/g。对此优化条件进行验证，考虑实际操作，选择液固比0.4 mL/g、装瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6目条件下进行3 次验证实验，提取的多糖平均含量为24.85 mg/g，和预期结果基本相符，回归模型的预测性能较好，可用于优化牛蒡固体发酵灵芝工艺。

2.5 菌丝多糖红外光谱检测结果

图5 牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖红外光谱检测图Fig. 5 Infrared spectrum of mycelial polysaccharide from G. lucidum

从图5可知，牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖具有典型的多糖特征吸收峰，3 343 cm－1处有强的—OH伸缩振动吸收峰，2 930 cm－1处有强的—CH3、—CH2、—CH等的—CH伸缩振动吸收峰，1 714 cm－1和1 633 cm－1处为羧基和酰胺基的振动吸收峰，1 416 cm－1有—CH变角振动吸收峰，1 329 cm－1和1 270 cm－1分别为—OH和—CH的变角振动吸收峰，1 217 cm－1处有—COOH中—OH变角振动吸收峰，1 158 cm－1和1 127 cm－1有吡喃糖环醚键中的C—O伸缩振动，1 029 cm－1处的则是醇羟基的变角振动吸收峰，935 cm－1处为吡喃型糖环特征吸收峰，988 cm－1和875 cm－1处存在β-型糖苷键的振动吸收峰，875 cm－1和818 cm－1处是甘露糖的振动吸收峰。

2.6 单糖组成分析

图6 单糖标准品的PMP柱前衍生高效液相色谱Fig. 6 HPLC profiles of monosaccharide standards with PMP pre-column derivatization

结合图6、7结果，经计算，每100 g牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖中，单糖组成主要为5.01 g甘露糖、0.67 g鼠李糖、0.66 g葡萄糖、1.54 g半乳糖、0.58 g木糖、1.27 g阿拉伯糖和0.22 g岩藻糖。

图7 牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖的PMP柱前衍生高效液相色谱Fig. 7 HPLC profiles of mycelial polysaccharide from G. lucidum with PMP pre-column derivatization

2.7 体外抗氧化活性分析

2.7.1 清除DPPH自由基的能力

图8 菌丝多糖和VC对DPPH自由基的清除效果Fig. 8 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on DPPH radical

由图8可知，菌丝多糖对DPPH自由基清除效果明显，在0～1 mg/mL范围内呈现量效关系，当菌丝多糖质量浓度为0.5 mg/mL时，清除率已经达到69.34%，说明菌丝多糖对DPPH自由基具有较好的清除能力。

2.7.2 清除超氧阴离子自由基的能力

图9 菌丝多糖和VC对超氧阴离子自由基的清除效果Fig. 9 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on superoxide anion radical

由图9可知，菌丝多糖对超氧阴离子自由基清除效果明显，在0～1 mg/mL范围内呈现量效关系，当菌丝多糖质量浓度为0.5 mg/mL时，清除率已经达到65.78%，说明菌丝多糖对超氧阴离子自由基具有较好的清除能力。

2.7.3 清除羟自由基的能力

图10 菌丝多糖和VC对羟自由基的清除效果Fig. 10 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on hydroxyl radical

由图10可知，菌丝多糖对羟自由基清除效果明显，在0～1 mg/mL范围内呈现量效关系，当菌丝多糖质量浓度为0.5 mg/mL时，清除率已经达到66%，说明菌丝多糖对羟自由基具有较好的清除能力。

3 讨 论

3.1 牛蒡固体发酵灵芝工艺的优势

3.1.1 固体发酵工艺的优势

本研究所选择的固体发酵工艺，其培养基为固态且缺少以连续相存在的水，相对于液体发酵工艺，设备简单、经济、能耗低，技术成本不高，后续处理过程也较为简便，易于产业化推广。同时由于固体发酵环境与大部分真菌在自然状态下的生长环境更为接近，因此也更有利于发酵活性产物的积累，而液体发酵由于含水量增加，会影响菌种的生理代谢过程，进而影响活性物质的组成与活性。例如盛悦等[17]对比了猴头菌液体、固体发酵产物多糖抗氧化活性后发现，固体发酵产物多糖抗氧化活性略优于液体发酵；段金柱等[18]对比了固体发酵与液体发酵生产纤维素酶的产率与催化性能，固体发酵在产量、质量和大规模生产方面均优于液体发酵。

3.1.2 以牛蒡为培养基固体发酵的优势

品质较低的牛蒡粗细不均、易弯曲易折断、口感差，在传统牛蒡加工过程中，不但不能作为出口原料，甚至会被作为废弃物处理，无法再利用，造成极大浪费。由于牛蒡中木质素、纤维素含量较高，并含有多糖、维生素、氨基酸等成分，为灵芝等药食真菌固体发酵提供了适宜的营养基质。采用低品质牛蒡固体发酵灵芝，菌丝生长速度、菌丝多糖含量与传统固体发酵无明显差异，工艺简单，可操作性强，不需额外添加化学试剂，既节省了原料和成本，又合理利用了牛蒡。目前本实验室已经利用低品质牛蒡，成功液体发酵了毛木耳、茶新菇、平菇，固体发酵了茶薪菇、金针菇、杏鲍菇等多个品种食用菌，显示出牛蒡在液体、固体发酵药食真菌中具有普遍的规律性和适用性，相关工艺技术已在药食真菌发酵、牛蒡综合利用、植物-药食真菌复合型饮料制备方面开展了系列应用，符合现代绿色、高效农业的理念，具有很好的推广前景。

3.1.3 牛蒡固体发酵灵芝多糖产量的优势

对比采用木屑培养基[19]，其组成为（质量百分比）木屑85%、麦麸12%、黄豆粉2%、石膏粉1%，液固比为1.5 mL/g，28 ℃固体发酵灵芝12 d后，测定多糖含量为（8.71±1.29） mg/g。付铭等[20]采用大米为基质，固体发酵灵芝；生东明等[21]采用麸皮、蔗糖为培养基，固体发酵灵芝；周小苹等[22]采用麦芽汁和茶叶固体发酵灵芝，均测定了菌丝体多糖含量。本研究在最佳工艺条件下牛蒡固体发酵灵芝后，多糖含量为24.85 mg/g，经比较后可知，高于木屑培养基和生东明等[21]的测定结果，但是低于付铭[20]、周小苹[22]等的研究结果，说明牛蒡固体发酵灵芝，多糖产量适中，适合进一步产业化推广。

3.2 牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖中单糖组分特点

于华峥[23]、黄静涵[24]等及冯胜平[25]曾对灵芝多糖中单糖组成进行过研究，Carlotto等[26]曾对牛蒡多糖中单糖组成进行过分析，经对比后发现，牛蒡固体发酵灵芝菌质多糖中单糖种类和数量未超出已报道的，但是各单糖所占比例则有所差异。Ai-Lati等[27]研究发现灵芝多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成，其中葡萄糖占比最高，为92.33%；郑一美等[28]报道牛蒡多糖中单糖由果糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中果糖含量最大，达到9.35%。本研究所获得的牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖，经红外光谱分析可知，在400～4 000 cm－1范围，具有糖类的特征吸收峰；经液相色谱分析发现，其单糖组成中甘露糖占比最高，为50.35%，是葡萄糖的7.6 倍，未检测出果糖成分。含量上的差异可能意味着灵芝重新分解与合成了牛蒡中的营养物质，使得多糖中单糖组成比例发生了较大变化。甘露糖作为目前被用于临床上的一种糖质营养素，能直接被利用合成糖蛋白，参与免疫调节，具有调节免疫系统的作用，提示本实验所制备的牛蒡固体发酵灵芝菌质多糖具有较好的优势和进一步利用的前景。

3.3 牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖的抗氧化能力

Tian Xing等[29]研究发现，牛蒡提取物能够减少脂质过氧化产物丙二醛的产生，防止活性氧的生成，具有较强的自由基清除能力，对过氧化氢诱导的细胞损伤有保护作用；灵芝水提物和灵芝多糖也具备清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力[30-32]。本研究发现，牛蒡固体发酵灵芝菌质多糖也具有相似的抗氧化能力。在质量浓度大于0.5 mg/mL时，菌质多糖表现出对3 种自由基都有较好的清除作用，且随质量浓度增大而增大。说明牛蒡固体发酵灵芝菌质多糖具有一定的还原能力，通过发生氧化还原反应，DPPH自由基、超氧阴离子自由基被还原，同时菌质多糖碳氢链上的氢原子能迅速与羟自由基结合成水，多糖的碳原子上留下一个成单电子，成为碳自由基，经进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物，达到对3 种自由基清除的作用。

4 结 论

通过响应面设计优化提取工艺，得出最佳方案为液固比0.4 g/mL、装瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6 目，在此条件下，多糖含量的最大值为24.85 mg/g。红外光谱扫描结果表明，牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖具有糖类的特征吸收峰，单糖间连接方式以β-糖苷键为主。高效液相色谱检测菌质多糖单糖组成为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等，其中甘露糖含量最高，为50.35%，是葡萄糖的7.6 倍。体外抗氧化性检测表明，牛蒡固体发酵灵芝菌丝多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基都具有清除能力，清除率均大于70%，说明多糖具有较好的体外抗氧化活性。