郑丽雪，王家皓，陈志鹏，齐 斌，王立梅*

（常熟理工学院 苏州市食品生物技术重点实验室，发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

随着人们对食品安全问题的关注度日益增强，天然防腐剂的开发应用受到广泛的重视。其中，微生物源防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）早在1969年就被联合国粮农组织/世界卫生组织批准为高效安全天然食品防腐剂，且目前有部分学者正在研究将Nisin应用于食品包装中；ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）于2003年10月被美国食品药品监督管理局批准为安全食品保鲜剂，美国、韩国和日本已经允许将ε-PL应用于食品保鲜防腐中；溶菌酶也已经广泛应用于肉制品、水产品和乳制品等食品防腐中[1-4]。此外，乳杆菌细菌素、曲酸、纳他霉素、罗伊氏菌素等微生物源防腐剂以及植物产生的次生代谢产物精油在食品工业以及化妆品行业中都有广泛的应用[5-11]。

近年来，具有抑菌活性的丙酸杆菌代谢物（丙酸杆菌细菌素）也备受关注，细菌素可通过多种机制抑制有害菌的生长[12-13]。法国罗地亚公司已经开发得到一种含有丙酸杆菌细菌素的新型生物防腐剂，得到了美国食品药品监督管理局的批准，产品已在美国和欧洲市场上销售[14]。孙帅等[15]将70%～80%的特氏丙酸杆菌代谢物与20%～30%的Nisin混合制成了一种新型生物防腐保鲜剂，这种保鲜剂天然安全无毒，而且抑菌谱广，将此保鲜剂应用于草莓的贮藏中，大大降低了草莓的呼吸强度，减缓了草莓的质量损失率，降低了草莓的腐烂率。目前，国内大量研究还是围绕高产丙酸杆菌素菌株的制备[16]、培养基的优化[17]、代谢物的抑菌活性[18]以及丙酸杆菌素的分离纯化[19]等方面，对于高密度发酵生产丙酸杆菌细菌素的研究较少，而高密度发酵是进行工业化生产的前提。

有学者发现单一碳源不利于丙酸杆菌的生长，丙酸杆菌的最适复合碳源为乳酸钠、葡萄糖分别15、5 g/L，在此基础上，研究还发现每隔24 h补加一次3 g/L的复合碳源，能最大程度地提高丙酸杆菌的抑菌活性[20-21]。目前高密度方面的研究都集中在丙酸杆菌生长所需的碳源上，对氮源的研究比较少。有研究报道玉米浆可以代替丙酸杆菌生长所需的最适氮源酵母粉，可以在一定程度上提高丙酸杆菌代谢物的抑菌活性[22]。据此，本研究尝试将玉米酒糟清液作为丙酸杆菌发酵所需的氮源，因为酒糟清液与玉米浆在碱度及营养物质含量上基本相似[23]，两者都含有蛋白质、脂肪、纤维素、矿物元素及少量的淀粉等营养物质，且玉米酒糟来源充足，运输方便且物美价廉。另外，有报道细菌素是具有抗微生物活性的肽或蛋白质[24-25]，本研究也将探讨实验菌株所产丙酸杆菌素的性质，分析其是否也属于蛋白类物质，为后续的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌种

菌种：Propionibacterium freudenreichii CS1420（保藏登记号CCTCC NO：M 2015050）、大肠杆菌（ATCC25922）均为常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程中心保存。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1B超净工作台 苏净集团安泰公司；YXQLS-100A型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；CR22G II型高速冷冻离心机 日本日立公司；PE20型实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FA604A型精密电子天平 上海精天电子仪器有限公司；XMARK型微孔板、分光光度计美国Bio-Rad公司；UV-2450型紫外分光光度计 日本岛津公司；NicoletIS10傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

将P. freudenreichii CS1420单菌落接种至改良胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培养基[14]中活化，30 ℃厌氧培养2.5 d。

1.3.2 扩大培养

将种子液按照10%接种量接入装有乳酸钠（sodium lactate broth，SLB）培养基[14]的三角瓶中，30 ℃厌氧培养2.5 d。

1.3.3 分批发酵

将扩大培养好的种子液按10%接种量接种至装有2 L SLB培养基的5 L发酵罐中，发酵温度30 ℃，转速100 r/min，发酵期间通入CO2使罐压保持0.05 MPa，控制pH 6.0，发酵时间8 d。

1.3.4 分批补加复合碳源

分批补加的复合碳源为75%乳酸钠和25%葡萄糖混合溶液。从高密度发酵的96 h开始，每隔24 h补加复合碳源和2 g/L的酵母粉，连续补充5 次，每次碳源、氮源分别补料100 mL，补料速率为10 mL/min，其余发酵条件参照1.3.3节。其中每次发酵时复合碳源补加量分别为2、2.5、3、3.5 g/L和4 g/L，进行5 次发酵确定最佳复合碳源添加量。

1.3.5 分批补加复合氮源

分批补加的复合氮源为2 g/L酵母溶液与玉米酒糟清液混合液。玉米酒糟清液是将酒糟与蒸馏水按照质量比1∶4配制，30 ℃搅拌3 h，5 000 r/min离心5 min，取上清液[26]。从高密度发酵96 h开始，每隔24 h补加2.5 g/L复合碳源和复合氮源，连续补充5 次，每次碳源、氮源分别补料100 mL，补料速率为10 mL/min，其余发酵条件参照1.3.3节。其中每次发酵时复合氮源补加量分别为酵母溶液与玉米酒糟清液体积比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，进行5 次发酵确定最佳复合氮源添加量。

1.3.6 指示菌的制备

将活化好的大肠杆菌接种至LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养至菌液的OD600nm为0.2，然后用无菌LB培养基稀释100倍备用。

1.3.7 丙酸杆菌素的制备

将发酵液在4 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，用2.5 mol/L NaOH溶液调至pH 7.0，再用10%酒石酸调至pH 5.5，然后将发酵液用截留分子质量为3 000 u的超滤膜进行超滤，去除较大分子物质，得到丙酸杆菌素粗提清液。

1.3.8 硫酸铵沉淀丙酸杆菌素的制备

将发酵液在4 ℃、8 000 r/min离心5 min，分别取离心上清液20 mL，边搅拌边缓慢向上清液中添加硫酸铵粉末（冰水浴），至硫酸铵终质量分数分别为30%、40%、50%、60%、70%，继续搅拌均匀，放于4 ℃冰箱中沉淀过夜，在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，将离心后的沉淀物进行冷冻干燥。

1.3.9 抑菌活性的测定

参照文献[27]并适当改进。将丙酸杆菌素粗提物用无菌的LB溶液进行2n梯度稀释，然后将不同稀释倍数的抑菌物质分别加入96 孔酶标板中，每孔总体积为200 μL，其中20 μL为不同稀释倍数的抑菌物质，180 μL为指示菌菌液。用20 μL空白LB液体培养基和180 μL指示菌菌液作为对照，将酶标板置于30 ℃恒温培养，每隔一定时间取出用酶标液测定各加样孔在600 nm波长处OD值。当OD600nm为对照组一半时的稀释度定义为一个抑菌活性单位，单位为AU/mL。

1.3.10 丙酸杆菌素的结构表征

1.3.10.1 红外光谱分析

取一定量充分干燥后的丙酸杆菌素，将其与一定量的KBr混匀后压片，在400～4 000 cm－1范围内进行红外光谱扫描[28]。

1.3.10.2 蛋白酶敏感实验[29]

抑菌活性检测：向牛津杯中加入250 μL溶液，将检测平皿放置在37 ℃培养箱培养24 h后观察抑菌效果。

蛋白酶敏感性检测：用胰蛋白酶和中性蛋白酶对硫酸铵盐析沉淀溶液进行酶解实验，首先调节硫酸铵盐析沉淀溶液的pH值至两种酶的最适作用值（pH 7.0、pH 2.0），各取1 mL分别加入两种酶，使酶终质量浓度为1 mg/mL，37 ℃水浴2 h，100 ℃加热l min灭酶，之后将pH值回调，进行抑菌活性检测，以未经酶处理的70%硫酸铵盐析沉淀溶液作为对照。

1.4 数据统计及分析

实验涉及数据处理均采用Excel 2016完成，所有作图均采用Origin 8.5完成。

2 结果与分析

2.1 分批发酵对丙酸杆菌生长的影响

图1 丙酸杆菌分批发酵规律曲线Fig. 1 Time courses of mycelial growth and antibacterial activity of propionin in fed-batch fermentation of P. freudenreichii

从图1可以看出，从96 h开始，丙酸杆菌菌体干质量增加缓慢，这表明从96 h开始丙酸杆菌的生长受到限制，其抑菌活性基本保持不变，最高抑菌活性为17.6 AU/mL。丙酸杆菌素的发酵过程中，不断分解利用还原糖，在进入发酵稳定期前大量消耗还原糖。在发酵进入稳定期后，丙酸杆菌素开始大量合成，由于其可能是蛋白质，而此时发酵液中还原糖和氨基氮含量已经很低，限制了其高效合成[20]。通过分批补加碳源和氮源的方式有助于丙酸杆菌在稳定期后高效合成丙酸杆菌素，提高丙酸杆菌素的产量。

2.2 分批补加复合碳源对丙酸杆菌素发酵规律的影响

图2 分批补加复合碳源对丙酸杆菌素发酵规律的影响Fig. 2 Effect of supplementation of carbon sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

从图2可以看出，当混合碳源添加量在2.5 g/L时，丙酸杆菌相对生长较好，菌体干质量最高，在该条件下的丙酸杆菌素抑菌活性最高，可以达到30.5 AU/mL。丙酸杆菌能在葡萄糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖等单一碳源培养基上生长[21]。而乳酸盐是丙酸杆菌可高效利用的碳源，其中乳酸钠是培养丙酸杆菌最常用的碳源[30]。而葡萄糖是工业生产中常用的碳源，研究表明丙酸杆菌在含有葡萄糖和乳酸盐的组合培养基中能更好地利用乳酸盐，从而提高丙酸杆菌素的产量[21]。因此该复合碳源最佳添加量为2.5 g/L。

2.3 分批补加复合氮源对丙酸杆菌素发酵规律的影响

图3 分批补加复合氮源对丙酸杆菌素发酵规律的影响Fig. 3 Effect of supplementation of nitrogen sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

从图3可看出，当酵母溶液与玉米酒糟清液体积比为1∶30时，丙酸杆菌的生长旺盛，菌体干质量相对较高，同时在此条件下发酵得到的丙酸杆菌素的抑菌活性最高，可以达到31.2 AU/mL。2 g/L酵母溶液是丙酸杆菌发酵最佳补加氮源[20]，但酵母价格较高，工业化生产成本较大，而玉米和普通酒糟中都富含氨基酸，玉米酒糟中氨基酸含量很高，可以提供足够的氨基氮，促进合成丙酸杆菌素，而且玉米酒糟价格低廉，可以大大降低工业化生产的成本，为工业化生产奠定良好的基础。因此该复合氮源最佳比例为1∶30。

2.4 丙酸杆菌素的结构表征

2.4.1 红外光谱分析[31-32]

图4 丙酸杆菌素红外光谱图Fig. 4 Infrared spectrum of propionin

从图4可见，肽链官能团—NH—CO—的特征吸收谱带。1 558 cm－1附近的吸收表示N—H相对于C=O以反式构型的形式存在；1 408 cm－1附近的吸收是顺式构型。这些吸收包含N—H弯曲振动和C—N伸缩振动的因素。1 638 cm－1的强吸收为肽键中的C=O双键的伸缩振动。2 976 cm－1和2 900 cm－1处的峰为饱和烷烃的C—H伸缩振动峰。3 412 cm－1处的宽峰为酰胺键中的N—H伸缩振动产生。

2.4.2 丙酸杆菌素蛋白酶敏感实验

表1 丙酸杆菌素蛋白酶解实验结果Table 1 Proteolytic sensitivity of propionin

图5 70 0%硫酸铵沉淀物抑菌效果与蛋白酶水解实验Fig. 5 Antibacterial activity and proteolytic sensitivity of bacteriocin precipitated with 70% ammonium sulphate

对丙酸杆菌素溶液进行蛋白酶解检测，结果如表1和图5所示，70%硫酸铵盐析沉淀溶液经胰蛋白酶和中性蛋白酶反应后，抑菌活性无。结合丙酸杆菌素的红外图谱以及其蛋白酶敏感实验可以确定，P. freudenreichiiCS1420产丙酸杆菌素是具有抑菌活性的蛋白类物质。

3 结 论

以分批补加碳源氮源的高密度发酵方法提高丙酸杆菌的生长量及其丙酸杆菌素的抑菌活性。创新性地在其发酵过程中用玉米酒糟清液代替部分酵母溶液作为碳源，在一定程度上提升了丙酸杆菌素的抑菌活性。研究得出两个结论：1）分批添加复合碳源和复合氮源后，分批发酵制得的丙酸杆菌素的抑菌活性从17.6 AU/mL提高到31.2 AU/mL；2）由P. freudenreichiiCS1420产生的丙酸杆菌素是具有抑菌活性的蛋白类物质。

来源于乳品中的丙酸杆菌素非常适合作为生物防腐剂作用于食品中，我国对丙酸杆菌素的应用研究较少，因此本研究为丙酸杆菌素的工业化生产作了一定铺垫，将对推动丙酸杆菌素的应用起一定作用，将激发其作为新型绿色安全防腐剂的潜力。