高兆建，许 祥，王先凤，芦 宁，王旭东，张铁柱，张抗震，焦 巍

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221018； 2.江苏天中牧业股份有限公司，江苏 徐州 221018；3.江苏太合食品有限公司，江苏 徐州 221018；4.邳州市金大地 肥料有限公司，江苏 徐州 221100）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯酶的一个亚类，能水解植物细胞壁中阿魏酸或酚酸与多糖之间的酯键[1]，使植物细胞壁容易释放出阿魏酸和多糖[2]。根据阿魏酸酯酶蛋白质初级结构的特征以及对4 种羟基化肉桂酸甲酯模式底物阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、p-香豆酸甲酯和芥子酸甲酯的专一性，阿魏酸酯酶分为A、B、C和D 4 种类型[3]。到目前为止，4 种类型的阿魏酸酯酶已经从黑曲霉中分离鉴定[4-5]，且研究发现其与内切木聚糖酶协同作用，促进了木质素的降解并增加阿魏酸的释放量[5]。木质素中阿魏酸酯键交联结构能极大强化生物质的牢固性和对酶解的抵抗性，阿魏酸酯酶则可解聚多糖链和去木质化[5]。因此，阿魏酸酯酶作为释放阿魏酸和促进生物质降解的一种关键酶，近年来备受关注。

阿魏酸酯酶可显著提高小麦麸皮、玉米芯、玉米糠、草木质纤维素材料的生物降解性能[6]，因此可以作为动物饲料添加剂加到饲料中提高饲料利用率[7]。在纸浆和造纸工业中，将阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及其他木聚糖降解酶联合用于生物制浆和生物漂白的纸浆，酶可部分破坏和松开细胞壁结构，随后木质素-碳水化合物复合物将更易受到酶的作用，其降解产物更容易被低浓度碱溶解和扩散[4]。在漂白阶段木质素的可萃取性增强，可以降低氯的消耗量，同时可以提高纸浆的亮度[8]。此外，阿魏酸酯酶在将可再生纤维素材料转化为乙醇燃料方面也发挥了重要作用[9]。阿魏酸酯酶降解生物质释放出的阿魏酸有抗菌消炎、防止血小板凝集形成血栓、抗肿瘤、增强机体免疫、抗癌和抗高血压等功能，是一种无处不在的羟基肉桂酸衍生物[10]。阿魏酸还可以用作抗氧化剂，已经证明它在体外有接近过氧硝酸盐和氧化低密度低脂蛋白活性[11]。阿魏酸和多糖在半纤维素网络中通过酯键形结合，通过形成醚键和木质素键合[12]，利用这些作用阿魏酸可以提高植物细胞壁的硬度和强度[13]。所以，从植物细胞壁中释放的阿魏酸不仅有利于生物质的降解[14]，对医药和食品行业也有一定潜在的应用价值[15]。由于阿魏酸对健康的有益作用[10]，有些食品行业正在通过添加阿魏酸强化食品的营养价值。

迄今为止，已经从多种微生物中分离纯化出了30多种阿魏酸酯酶，其中许多来自真菌，如泡盛曲霉[16]、黄曲霉[17]、黑曲霉[18]、互隔交链格孢霉[19]等，但也有细菌的报道如发酵乳杆菌[20]。在大多数文献报道中，阿魏酸酯酶在碱性条件下用于纤维素材料的降解，且大多数报道的阿魏酸酯酶在中性或碱性条件下活性高[4]。然而许多饲料在加工时处于酸性条件，且动物胃也为酸性条件，已报道的阿魏酸酯酶活性会受到抑制。虽然已经从细菌和真菌生产出了许多类型的阿魏酸酯酶，但它们的商业化应用受到低催化活性和昂贵成本的限制[21]。为此，越来越多的研究者投身于寻找性能更为优良的阿魏酸酯酶。这些应用领域需要不同类型的阿魏酸酯酶适应pH值、温度、稳定性或其他一些特征的变化。

针对这些问题，实验室从深绿木霉XS6的发酵液中提取到了一种深绿木霉阿魏酸酯酶（Trichoderma atroatroviride feruloyl esterase，TaFAE）。该酶的酸碱稳定性强、酸性环境下活性高，在食品和饲料行业应用前景广阔。本实验是从保藏菌株中分离出阿魏酸酯酶，并研究其酶学性质。本实验旨在为后续研究提供理论基础，扩大阿魏酸酯酶在生产实践中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

深绿木霉（Trichoderma atroatroviride）XS6，本实验室保藏。

1.1.2 试剂

阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸乙酯、对香豆酸甲酯、芥子酸甲酯、咖啡酸甲酯、对羟基肉桂酸甲酯美国Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、(NH4)2SO4、甲叉双丙烯酰胺、牛血清蛋白 生工生物工程（上海）股份有限公司；DEAE-Cellulose DE52、Sephadex G-200 瑞典Pharmacia公司；蛋白分子质量Marker 日本TaKaRa公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KTA Explorer 100/Explorer 10型蛋白质纯化系统美国G E公司；2-D E l e c t r o p h o r e s i s电泳系统美国Hoefer公司；3K30型台式冷冻离心机 德国Sigma公司；1100 series高效液相色谱仪 美国Agilent公司；CascadaTMAN型超纯水系统 美国Pall公司；UV-2450紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备

将菌株接种于PDA平板，28 ℃培养4～5 d。切取1 cm2菌苔接种于PDA种子培养基，28 ℃、150 r/min培养3～4 d，以10%的接种量接种于液体发酵培养基，30 ℃、180 r/min 培养6 d。将得到的发酵液12 000 r/min离心10 min，收集上清液即粗酶液。

发酵培养基配方：2 g/100 mL蔗糖，1 g/100 mL酵母提取物，0.5% NH4H2PO4，0.2% NaNO3，0.2% KH2PO4，0.1% NaCl，0.05% MgSO4·7H2O；pH 5.5。

1.3.2 酶的分离纯化

1.3.2.1 (NH4)2SO4分级沉淀

在取得的粗酶液中加入固体(NH4)2SO4至饱和度为40%，在4 ℃过夜，12 000 r/min离心10 min后，取上清液加入固体(NH4)2SO4至饱和度为75%，4 ℃过夜，12 000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀在10 mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液中充分透析，除去杂盐离子，然后用超滤管对酶液进行浓缩。

1.3.2.2 离子交换层析

将上述蛋白溶液选用DEAE-Cellulose DE52阴离子色谱交换柱进行分离，缓冲液选用20 mmol/L、pH 6.0磷酸缓冲溶液，流速为1.0 mL/min。超滤脱盐后的粗酶液上样至充分平衡后的离子交换层析柱，先用平衡缓冲液洗脱柱子至蛋白吸收线走平，再用含NaCl浓度为0～1.0 mol/L的相同缓冲液线性梯度洗脱，流速为1.5 mL/min。测定波长280 nm处紫外吸光度，并检测收集管酶活性。

1.3.2.3 分子筛凝胶过滤层析

收集有酶活性的收集管，进行超滤浓缩。上样于Sephadex G-200分子筛凝胶柱并洗脱，流动相为20 mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液，流速0.8 mL/min。分别测定各收集管酶活性并收集有活性部分，用于酶纯度和酶学性质检测。

1.3.3 酶活性检测

通过分析从阿魏酸甲酯释放的游离阿魏酸测定TaFAE活性。方法参照文献[21]略作改动：40 ℃条件下，在含有1 mmol/L阿魏酸甲酯的50 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液（pH 4.0）中反应20 min，然后通过高效液相色谱[22]分析释放的游离阿魏酸。每分钟酯解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需酶量定义为1 个酶活性单位。

1.3.4 蛋白含量测定

采用Bradford法[23]，用牛血清白蛋白制作标准曲线，对蛋白进行定量。

1.3.5 蛋白质分子质量测定

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对该酶进行纯度鉴定，分离胶为12%，浓缩胶为5%，电压120 V，以低分子质量蛋白质Marker为标准，考马斯亮蓝R-250染色。

1.3.6 酶学性质分析

1.3.6.1 温度对TaFAE活性和稳定性的影响

酶液在50 mmol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液（pH 4.0）中适当稀释，20～70 ℃反应20 min，测定酶活性，确定酶的最适反应温度。将酶分别置于不同温度（30、40、50、60、70 ℃）下保温4 h，每隔40 min检测1 次酶活性，以未经过热保温的酶液为空白对照，检测酶的热稳定性。

1.3.6.2 pH值对TaFAE活性和稳定性的影响

使用不同pH值的50 mmol/L缓冲液（pH 2.0～3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液、pH 3.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液、pH 6.0～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 8.0～8.5的Tris-HCl缓冲液、pH 9.0～11.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），于40 ℃测定酶活性，以酶活性最高者为100%，计算相对酶活性，以研究TaFAE酶促反应最适pH值。将酶液分别置于不同缓冲体系构成的不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）条件下，于30 ℃放置4 h后测定剩余酶活性，以酶活性最高者为100%，计算相对酶活性，以研究TaFAE的pH值稳定性。

1.3.6.3 金属离子及各试剂对酶活性的影响

TaFAE酶液在最佳pH值条件下的大体积缓冲液中透析24 h除去酶液中的内源金属离子。用蒸馏水配制金属溶液，反应体系中金属离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Co2+浓度分别1 mmol/L和5 mmol/L，然后测定反应体系添加金属离子后TaFAE活性，以未添加金属离子反应体系测得酶活性为100%，计算相对酶活性。

将纯化后的酶液与不同浓度的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、SDS、Tween 80、苯甲基磺酰氟、二甲基亚砜、Trition X-100、甲醇、乙醇等试剂一起孵育1 h，按照标准方法测定残余酶活性。分析各化学试剂对TaFAE活性的影响，以不加任何试剂的酶活性为100%，测定不同试剂下的相对酶活性。

1.3.7 TaFAE的底物特异性及动力学分析

在40 ℃和pH 4.0条件下，测定TaFAE对不同底物的反应初速度，各底物浓度范围为0.1～8 mmol/L。通过高效液相色谱检测产物浓度。用Lineweaver-Burk作图法：1/V-1/[S]作图，得到动力学曲线，得到TaFAE的Km、Vmax。TaFAE底物包括：阿魏酸甲酯、对香豆酸甲酯、咖啡酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸乙酯和对羟基肉桂酸甲酯。

1.3.8 TaFAE作用于脱淀粉麸皮释放阿魏酸的功能

以去淀粉后的粉碎过筛小麦麸皮为原料，参照文献[7]碱法提取麸皮中的总阿魏酸。以碱法提取的阿魏酸量为100%参照，判断TaFAE酶解释放阿魏酸量。向1 mL 20 mmol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中，分别加入20 mg预处理后的麸皮及2 U纯化后的TaFAE。为分析木聚糖酶与TaFAE协同水解麸皮释放阿魏酸的作用，另取第2支离心管在以上添加体系的基础上再加入4 U木聚糖酶。再取第3支离心管加入相同缓冲溶液和底物，再仅加入4 U的木聚糖酶。以体系中不加任何酶为空白对照。以上离心管均于40 ℃摇床中孵育12 h，沸水中10 min灭活酶，10 000 r/min离心10 min，取上清液高效液相色谱法检测阿魏酸量。

1.3.9 TaFAE在生物质降解中的应用

以粉碎后过100 目筛的玉米芯、玉米秸秆、脱淀粉小麦麸皮为底物，以水解后产物葡萄糖为测定指标，分析TaFAE及其与木聚糖酶协同降解生物质的作用。具体测定方法按照文献[17]，略有改动。反应体系为：20 mmol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 4.0）6 mL，反应底物1 g，2 mg木聚糖酶和2 mg TaFAE，补充去离子水至10 mL。对照的反应体系不加TaFAE，其他相同。在温度40 ℃、转速100 r/min摇床中，反应2 h，3,5-二硝基水杨酸法测定水解产物葡萄糖含量。

1.4 数据统计与分析

实验数据用Microsoft Excel进行统计分析并作图，结果用 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 TaFAE的分离纯化

将经过(NH4)2SO4盐析、透析6 h除盐后的粗酶液上样DEAE-Cellulose DE52弱阴离子交换柱，缓冲溶液充分洗脱，去除未结合的杂蛋白，然后改用线性NaCl浓度对蛋白进行梯度洗脱，得到多个较大洗脱峰。如图1所示，将收集管进行酶活性检测，活性主要分布在40～52号收集管，对应NaCl洗脱浓度0.5～0.7 mol/L。合并有活性的收集管测定蛋白浓度和酶活性并进一步纯化。

图1 DEAE-Cellulose DE52阴离子交换层析洗脱曲线Fig. 1 Chromatographic profile of protein by DEAE-cellulose DE52

图2 Sephadex G-200凝胶柱洗脱曲线Fig. 2 Chromatographic profile of protein by Sephadex G-200

离子交换层析后的收集样超滤浓缩后上样Sephadex G-200色谱柱，洗脱曲线见图2，样品溶液分离后得到了3 个独立的洗脱峰，说明TaFAE与其他蛋白有较好分离。对收集管进行酶活性测定发现，18～24号收集管表现出了很强的TaFAE活性，这与2号蛋白峰完全对应，表明TaFAE集中在峰2。经过分子筛凝胶过滤层析后，酶比活力显著增加至134.3 U/mg，纯化倍数31.52，回收率为28.9%，各步纯化情况如表1所示。

表1 深绿木霉XS6 TaFAE各步纯化情况Table 1 Summary of the purification steps of TaFAE

2.2 TaFAE纯度和分子质量的测定

从图3可以看出，只经过(NH4)2SO4盐析后的酶液有许多条蛋白条带，说明杂蛋白含量多；再经过离子交换层析后得到的条带明显减少，共9 条带，蛋白质得到了较好的纯化；最后经过凝胶过滤层析后只得到1 条带，说明得到了纯的TaFAE。根据标准蛋白的标准曲线方程计算出TaFAE的分子质量为66.4 kDa。

图3 TaFAE纯化过程的SDS-PAGE图谱Fig. 3 SDS-PAGE pattern of proteins during the puri fication of TaFAE

2.3 温度对TaFAE活性的影响

图4 TaFAE的最适反应温度Fig. 4 Optimal temperature of TaFAE

从图4可以看出，TaFAE的最适反应温度为40 ℃，在30～45 ℃范围内TaFAE均能保持90%以上的活性，当温度超过50 ℃时酶活性下降较快。在实验时间内，30～40 ℃条件下，该酶始终保持85%以上活性；在60～70 ℃时，实验时间内，酶几乎已完全失活。实验结果表明TaFAE的最适作用条件为30～40 ℃。

图5 温度对TaFAE稳定性的影响Fig. 5 Effects of temperature on stability of TaFAE

如图5所示，酶在50 ℃孵育120 min后，相对活性仍可维持在80%以上，60 ℃孵育80 min后，相对活性在75%以上。而在70 ℃仅孵育40 min，相对酶活性就降至20%以下。30 ℃或40 ℃孵育200 min，酶活性都能保持90%以上。

2.4 pH值对TaFAE活性及稳定性的影响

图6 TaFAE的最适pH值及其pH值稳定性Fig. 6 Optimal pH and pH stability of TaFAE

从图6可以看出，TaFAE活性在pH 3.0～7.0内略有起伏但均能保持80%以上，最适pH值在4.0。pH值大于7.0时酶活性急剧下降，在pH 8.0，酶活性骤降至40%，pH值为11.0时酶几乎失活。这说明碱性条件不利于TaFAE的催化降解反应，而中酸性条件酶活性都非常高。

pH值在2.0～9.0内，该酶能保持80%以上活性；pH值大于9.0时酶活性剧烈下降，pH 11.0时，TaFAE几乎失活。由此可见TaFAE能够在较为宽广的pH值范围内保持稳定，特别是在酸性条件下耐受力更强，在极碱性条件下酶活性稳定性变差。

2.5 金属离子及化学试剂对TaFAE活性的影响

表2 各种金属离子对TaFAE活性的影响Table 2 Effect of various metal ions on TaFAE activity

如表2所示，Ca2+和Mg2+对酶活 性有较强的促进作用，其中Mg2+的促进效果最明显，在1 mmol/L时达到107%，随着Mg2+浓度升高酶活性增强，浓度在5 mmol/L时，TaFAE相对活力达到118.7%；Hg2+和Pb2+有强烈的抑制作用，在高浓度下可以使酶完全失活；Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+在低浓度时对酶活性有轻微的抑制作用，但当浓度升高时，对酶活性的抑制作用增强；而Mn2+和Ba2+高浓度时几乎没有抑制作用；其余金属离子对酶活性的影响不大，说明TaFAE与大多数离子有良好的配伍性能。

表3 试剂对TaFAE活性的影响Table 3 Effect of various reagents on TaFAE activity

由表3可知，SDS对酶活性具有明显的促进作用，相对酶活性达到115%；β-巯基乙醇仅次于SDS，相对酶活性达到了112%；另外，二硫苏糖醇和Trition X-100对酶活性也具有促进作用。说明硫醇基团对酶的稳定性有促进作用。苯甲基磺酰氟对酶活性抑制较明显，将TaFAE的活性降到原来的一半，达到55.6%；碘乙酰胺也有一定的抑制作用，酶活性降到81.7%；其余试剂对酶活性影响不大，均能保持90%以上酶活性。

2.6 TaFAE底物特异性及动力学分析

表4 纯化后的TaFAE底物特异性分析Table 4 Substrate specificity of purified TaFAE

动力学反应参数-米氏常数（Km）是酶催化反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作图法，测定不同底物（阿魏酸甲酯、对香豆酸甲酯、咖啡酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸乙酯、对羟基肉桂酸甲酯）的动力学曲线，求出各种底物Km、Vmax。从表4可以看出，TaFAE对阿魏酸甲酯的亲和性最高，芥子酸甲酯次之，对对羟基肉桂酸甲酯亲和性最小，对咖啡酸甲酯无活性。从最大酶促反应速率来看，以芥子酸甲酯为底物时反应速率最大，为32.21 μmol/（min·mg），约是阿魏酸甲酯的2 倍，阿魏酸乙酯的3.3倍，对羟基肉桂酸甲酯的23 倍。以对香豆酸甲酯为底物时的反应速率次于芥子酸甲酯，达到25.98 μmol/（min·mg）。说明该酶具有严格的底物特异性。

2.7 TaFAE作用于脱淀粉麸皮释放阿魏酸的功能

图7 TaFAE水解麸皮释放阿魏酸Fig. 7 Release of ferulic acid from wheat bran by TaFAE

如图7所示，随着酶解时间的延长，TaFAE和木聚糖酶共同作用产生阿魏酸的量是TaFAE单独水解麸皮产生阿魏酸的2 倍以上，这说明，TaFAE和木聚糖酶在水解麸皮释放阿魏酸上具有良好的协同作用，能够促进阿魏酸的生成。

2.8 TaFAE在生物质降解中的应用

以不同底物检测TaFAE的降解作用，结果如图8所示。以玉米芯为底物，不加TaFAE时，还原糖产量为0.52 g/L，加入TaFAE时产量达到0.79 g/L。同样，在以玉米秸秆和小麦麸皮为底物时，还原糖产量分别增加了0.2 g/L和0.4 g/L，产量增加了1 倍。再次说明TaFAE和木聚糖酶具有良好的协同作用。

图8 TaFAE对生物质的水解作用Fig. 8 Synergistic hydrolysis of biomass by TaFAE and xylanase

3 讨 论

本研究从深绿木霉中提取出TaFAE，粗酶液经过系列纯化后，得到电泳纯的TaFAE，利用SDS-PAGE检测其分子质量约为66.4 kDa，同其他多种来源的阿魏酸酯酶相接近，如来源于红汁乳菇（Lactarius hatsudake）（55 kDa）[7]、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）（62 kDa）[10]、柄篮状菌（Talaromyces stipitatus）（69 kDa）[10]。但远大于隐球菌属（Cryptococcus sp. S-2）（34 kDa）[24]、米曲酶（Aspergillus oryzae）（30 kDa）[25]、黄曲霉（Aspergillus flavus）（40 kDa）[26]、Fusarium oxysporum（31 kDa）[27]等来源的阿魏酸酯酶分子质量。真菌产TaFAE的分子质量一般在30～70 kDa之间，少数可达210 kDa和11 kDa[28-29]。本研究获得的TaFAE的分子质量在以上区间内，但没有发现分子质量相同的阿魏酸酯酶报道。

本研究纯化的TaFAE最适反应温度为40 ℃，与Chandrasekharaiah等[30]报道的40 ℃相一致，而且与多种来源的相接近，Levasseur等[18]从重组表达的FA E温度为40～55 ℃，Vafiadi等[31]报道的嗜热孢子菌所产酶最适温度为45 ℃。此温度靠近动物消化道温度，能够更好地促进营养物质的消化吸收，因此该酶比较适合作为饲料添加剂。

本实验所得的酶的最适pH值为4.0，在pH 3.0～9.0范围内具有很高酶活性。最适pH值远小于其他报道过的TaFAE，比如Wang Xiaomei等[15]在解淀粉芽孢杆菌分离出的酶最适pH值为8.0，Yao Jian等[32]从土壤宏基因组筛到的阿魏酸酯酶最适pH 7.0，从串珠镰刀菌（Fusarium proliferatum） NRRL 26517[1]分离出的阿魏酸酯酶最适pH值为6.5～7.5，方园等[33]从泡盛曲霉分离出的酶最适pH值为6.0，对比以往报道的阿魏酸酯酶，pH值大 都在接近中性或偏碱性[34]，还鲜见在酸性达到pH 4.0时还能具有最强活性的阿魏酸酯酶的报道。本研究的TaFAE不仅在非常酸的环境下保持高活性，而且能够在pH 2.0～9.0的广泛酸碱范围内保持稳定性，4 h酶活性都保持在80%以上。TaFAE在高酸环境的强催化活性，是该酶的突出酶学特性优势，使其更能胜任在酸性较低的苛刻环境下工作。另外，TaFAE还保持了中性偏碱性条件下酶活性的稳定性，在温度适宜的条件下，该酶在食品、饲料和造纸等方面会有更广泛的使用。

经过离子浓度影响的测定后发现，Ca2+和Mg2+对酶活性有强烈的促进作用，严重抑制酶活性的常用金属离子并不多，说明该酶具有很好的配伍性。从不同化学试剂对酶活性影响的结果来看，TaFAE不仅对表面活性剂SDS和Trition X-100表现出强的耐受性，反而酶活性得到显著激活，表明TaFAE可以在洗涤剂中使用。还原剂β-巯基乙醇和二硫苏糖醇也增强TaFAE的活性，说明TaFAE中存在巯基，以上还原剂同巯基结合能够改变到酶的立体结构，从而促进酶活性。

对该酶底物特异性研究表明，TaFAE对阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯及芥子酸甲酯等多种底物均具有较高催化活力，说明TaFAE能够打断多种聚合多糖结构的交叉支链结构，这对从纤维素、半纤维素等多聚物中分离木质素转化可发酵糖具有特别重要的意义。以木聚糖含量高的农副产物为底物，检测TaFAE的降解作用显示，无论是水解麸皮产生阿魏酸还是在不同底物下产还原糖，TaFAE与木聚糖酶共同作用下，产生的阿魏酸和还原糖的量均比只用一种酶作用时的产量高，说明TaFAE和木聚糖酶在水解底物方面有良好的协同作用，TaFAE对多聚糖侧链的降解更有助于木聚糖酶对木聚糖主链的降解作用。Zhang Shuaibing等[26]报道源于黄曲霉（Aspergillus flavus）基因重组表达的阿魏酸酯酶同木聚糖酶协同作用降解汽爆玉米秸秆阿魏酸产量达到42 μmol/L，高于木聚糖酶单独作用13 倍；Gao Le等[4]报道将阿魏酸酯酶同纤维素酶共同对玉米芯粉、小麦麸皮和木薯酒糟渣降解，还原糖产量比纤维素酶单独作用分别提高了38.6%、15.6%和20.0%；Koseki等[35]将米曲酶（A. oryzae）中的阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母中重组表达，重组酶当同木聚糖酶共同作用于小麦阿拉伯糖基木聚糖时，阿魏酸产量高于木聚糖酶单独作用的3.1 倍。本研究的TaFAE在协同降解特性方面同报道的相类似，因此在食品、饲料等工业中，TaFAE可以和其他多种多聚糖糖酶协同作用，促进多聚糖的降解。

4 结 论

本研究从野生菌株深绿木霉XS6中纯化出阿魏酸酯酶，与基因工程菌株重组得到的阿魏酸酯酶相比更易为消费者所接受。通过对TaFAE酶学特性研究发现，与以往文献报道的阿魏酸酯酶有较大区别，在多方面有创新特性。TaFAE的突出特点是能够在非常酸的环境下保持高稳定性和活性，为特定环境下的酶的需求提供了更好的来源。另外，TaFAE在较高的温度下保持了较好的稳定性，60 ℃维持80 min，相对活性在75%以上。在金属离子、表面活性剂、还原剂等作用下以及底物降解特异性等方面TaFAE也表现出了优良的酶学特性。因此，本研究的TaFAE有潜力在食品、饲料、生物燃料、纺织、造纸、医药等领域广泛应用。