康建依，洪 洁，高 逸，杨 悦，陈 孟，易欣欣，高秀芝*

（食品质量与安全北京实验室，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室，北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206）

我国作为世界蔬菜生产大国，蔬菜样式多种多样，但蔬菜深加工还在起步阶段，蔬菜的盐（泡）渍贮藏及加工是我国食品的重要发展部分。传统发酵食品中蔬菜的盐（泡）渍贮藏加工是我国最常见的蔬菜加工方法之一，并且历史悠久，世代相传，享誉全球[1]，其发酵产品不仅风味独特诱人，而且富含大量维生素、氨基酸和矿物质[2]，可以在缺乏新鲜蔬菜摄入时补充营养。

在我国研究的发酵蔬菜大多为四川泡菜和东北酸菜，除此之外，在我国山西地区也有一种清爽可口的地方发酵蔬菜，俗称为“烂腌菜”，是以新鲜蔬菜为主料，包括圆白菜、芹菜、胡萝卜和辣椒等，以中低浓度的盐水腌制[3]。在厌氧环境中，利用蔬菜自身附着微生物或人工添加发酵菌种进行乳酸发酵而制成的发酵蔬菜，在保留蔬菜清香、脆嫩及美味的同时又增添酸度使其不仅风味独特、营养丰富，又能起到助消化、解腻开胃等效果[4-5]。

传统发酵食品在中国饮食文化中具有很重要的地位。然而，由于缺乏对发酵过程中微生物菌群的研究，大多数传统发酵食品的生产仍然是依据经验，这使得发酵过程难以控制。高通量测序技术已被证明是探索复杂环境微生物和跟踪发酵过程的有效研究手段[6]，可以更客观地揭示传统发酵食品发酵过程中微生物菌群的变化，且此技术已被应用于泡菜整个发酵过程中微生物演替的研究。目前，尚鲜见对于山西地方特色发酵蔬菜（俗称“烂腌菜”）细菌多样性分析的研究报道。本研究基于高通量测序方法对地方发酵蔬菜不同阶段微生物菌落结构和多样性进行分析，对地方发酵蔬菜化学指标进行检测分析，从而更全面地展现地方发酵蔬菜的微生物多样性，为进一步研究特色发酵蔬菜提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、孟加拉红琼脂培养基 北京陆桥生物技术有限责任公司；MRS培养基 奥博星生物技术公司；氯化钠、亚硝酸钠（均为分析纯） 北京化工厂；对氨基苯磺酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；十水合四硼酸钠、二水合乙酸锌（均为分析纯） 广东汕头西陇化工厂；通用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit） 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3B型酸度计 上海雷磁仪器厂；DL-CJ-1N超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 地方自然发酵蔬菜样品采集

在北京地区山西面馆采集地方发酵蔬菜样品，为面馆自制发酵而成（面馆以每周为1 个制作周期，发酵蔬菜工艺制作成熟，品质稳定）。发酵方法：将新鲜圆白菜、芹菜和胡萝卜（质量比为8∶1∶1）洗净切丝，蔬菜、4%盐水和老汤（多次制作发酵蔬菜的发酵液）的质量比为10∶9∶1，混匀。将混合好的蔬菜放入坛子中，蔬菜总量约为15 kg，用石头压实，盖好放置于阴凉通风地。取未经发酵的混合样品为0 d（记为V0），连续发酵7 d，每天从坛子中的3 个不同位置取样各30 g，作为平行样品，依据取样天数分别记为V1、V2、V3、V4、V5、V6和V7。

1.3.2 地方自然发酵蔬菜指标测定

将25 g样品加225 mL生理盐水均质2 min，10 倍梯度稀释。根据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[7]和GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[8]分别对样品中细菌总数和乳酸菌数进行测定；采用pH计测定样品pH值；根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[9]对样品中总酸进行测定；亚硝酸盐检测参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[10]，亚硝酸盐标准曲线方程为y=0.110 1x－0.004，R2=0.998 1。

1.3.3 样品总DNA提取

采用生工柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取样品总DNA，提取步骤根据说明书进行。以提取的总DNA为模板，采用16S rDNA V3-V4区设计引物为338F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’），502R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）在引物末端加上测序接头进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共25 次循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增、检测工作均由北京理化分析检测中心完成。

1.3.4 高通量测序数据分析

用Illumina HiSeq 2500对16SrDNA基因的V3-V4区进行测序得到不同发酵时间样品基因文库，使用QIIME（version 1.8.0）软件中的 UCLUST[11]对Tags在97%的相似度水平下进行聚类、获得操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）。利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，并且计算Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数，对样品的微生物多样性进行评价，以评估当前的测序量是否代表了主要群落的多样性，以及样本的大小是否合理。基于菌群之间Unifrac[12]算法非加权的主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可以实现多个样品的分类。

1.4 数据分析

利用Excel 2007和SPSS 18分析软件对数据进行统计分析，并结合Duncan法多重比较，所有实验均重复3 次，结果用 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 地方自然发酵蔬菜指标测定结果

2.1.1 地方自然发酵蔬菜发酵过程微生物变化

地方自然发酵蔬菜在制作工艺中，前期加入地方老汤进行发酵，原料中细菌总数和乳酸菌数较多，从图1可知，地方自然发酵蔬菜细菌总数和乳酸菌数变化趋势相似呈现先下降后上升的变化趋势，发酵后期菌数趋于平稳。在第0天，由于发酵方式为自然发酵，且原料蔬菜中本身带有部分细菌，细菌总数为4.3×107CFU/g，乳酸菌数为7.2×106CFU/g，发酵3 d，细菌总数与乳酸菌数分别为9.1×106CFU/g和7.8×106CFU/g，说明乳酸菌已成为蔬菜发酵过程中的优势菌，发酵5 d，细菌总数和乳酸菌数均达到峰值分别为5.5×107CFU/g和1.6×107CFU/g，发酵后期细菌和乳酸菌的死亡速度加快，使菌落数均略有下降后趋于平稳，细菌总数和乳酸菌数分别为1.2×107CFU/g和2.5×106CFU/g。

图1 蔬菜发酵过程中微生物菌落数Fig. 1 Changes in microbial populations during vegetable fermentation

2.1.2 地方自然发酵蔬菜发酵过程化学指标分析

亚硝酸盐含量是评价发酵蔬菜安全性的重要指标，通常接种发酵产生的亚硝酸盐含量低于自然发酵[13]。在蔬菜发酵过程中，pH值和总酸对微生物生长和发酵中代谢物的产生有很大影响。如图2所示，随着发酵时间的延长，发酵蔬菜的pH值逐渐降低，相应的总酸含量逐渐上升，在发酵前期（0～2 d），pH值迅速降低，总酸含量明显升高，亚硝酸盐含量缓慢上升，2 d样品的亚硝酸盐含量达到最高值为0.41 mg/kg，发酵中后期，发酵蔬菜pH值和总酸含量变化较小且亚硝酸盐含量缓慢降低，发酵结束后地方发酵蔬菜中的pH值为3.22，总酸含量为1.98 g/kg，亚硝酸盐含量为0.15 mg/kg，远低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》腌渍蔬菜亚硝酸盐限量规定的20 mg/kg[14]。发酵前期（0～2 d）乳酸菌数逐渐下降，部分杂菌可利用蔬菜中的硝酸盐还原生成亚硝酸盐，使亚硝酸盐达到最大，在发酵中期乳酸菌数的增加及稳定的群落对蔬菜发酵过程中的其他有害微生物产生抑制作用，减少了亚硝酸盐的生成[15]，此时，随着发酵时间的延长，乳酸菌的生长使乳酸含量增加，从而引起酸度变化[16]。

图2 蔬菜发酵过程中亚硝酸盐、pH值和总酸的变化Fig. 2 Changes in nitrate content, pH and total acid content during vegetable fermentation

2.2 地方自然发酵蔬菜细菌丰度和多样性分析

通过细菌16S rDNA基因V3-V4区测序，8 个样品产生408 663 条有效序列，统计所有样品优质序列长度均为414～429 bp。所有序列依据97%的相似度进行OTU分类。由图3可知，随着测序量的增加，细菌稀释曲线接近平台期达到饱和，表明样品中的物种多样性丰富程度高。

图3 样品的细菌稀释曲线图Fig. 3 Rarefaction curves for bacterial samples

表1 样品的信息、序列丰度以及微生物多样性Table 1 Sequence abundance and microbial diversity in samples

基于在97%相似度水平的OTU数，各样品Alpha多样性指数值统计如表1所示，发现V4中具有较丰富的多样性。Chao1指数和ACE指数衡量物种丰度，ACE指数与OTU数结果相似。8 个样品中的Simpson指数和Shannon指数在0.22～2.23之间，V1～V7的Simpson指数和Shannon指数呈反比，且V1、V7数值相差较多，V7的多样性指数最高。另外还统计了OTU覆盖率，其数值在0.999 3～0.999 7之间，结果表明，取样合理覆盖程度较高，能够反映出样品的真实情况。

2.3 地方自然发酵蔬菜细菌菌群结构分析

图4 蔬菜发酵过程中属水平菌群结果（A）和系统进化树（B）分析Fig. 4 Analysis of fl ora structure at genus level (A) and phylogenetic tree (B) during vegetable fermentation

地方自然发酵蔬菜的发酵过程在属水平上的群落演替如图4A所示，可以看出魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）、泛菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、环丝菌属（Brochothrix）、欧文氏菌属（Erwinia）及不动细菌属（Acinetobacter）等多种菌群在早期发酵阶段中存在，图4中未知菌属（unknown）代表未得到分类学注释的物种。一般发酵蔬菜的原料中均带有大量微生物，包括乳酸菌、酵母菌、肠杆菌及假单胞菌等，且通过细菌和真菌共同参与发酵成成品[17]。随着发酵时间的延长，乳杆菌属迅速成为细菌群落的主要菌属，V7中乳杆菌属含量为93.5%，乳杆菌属能够在糖酵解途径和发酵过程中发挥重要作用[18]。

基于属分类学水平上丰度最高的OTU序列，进行多重序列比对并构建系统进化树，如图4B所示，进化树中每条树枝代表一个物种，树枝长度为两个物种间的进化距离，即物种的差异程度，其中相同颜色属名代表所属于相同的门，在门水平有5 个，分别是放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteridetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），其中变形菌门是系统发生树中最大的分支，但相关性较少，变形菌门菌属大部分来自于土壤中种植的新鲜蔬菜，厚壁菌门分支较大且相关性较高，厚壁菌门中有多种益生菌种属，如乳杆菌属、明串球菌属及肠球菌属等[19]，与属水平相对含量图分析相似。

2.4 地方自然发酵蔬菜细菌群落相似性分析

对样品间进行物种丰度信息Unifrac分析，如图5所示，发酵蔬菜共4 次移位，其中有两次快速移位，两次较慢移位。第1次快速移位发生在PC1的V0～V1，显著性约为70%，符合pH值在此阶段的快速下降和属水平相对含量的变化。第2次快速移位发生在PC2的V1～V2，可能与异型和同型发酵乳酸菌在发酵中存在交替和消长有关。PCoA图两次较慢移位分别发生在V2～V4和V4～V7，前者在PC2呈负相关，可能表示此期间产生的一些代谢物减少，后者在PC1呈正相关，结合此时代谢物与菌属相对含量，分析表明，发酵过程趋于平稳，与微生物乳酸菌计数的变化结果相似。

图5 蔬菜发酵过程细菌菌群结构Unifrac非加权PCoA分布图Fig. 5 Un-weighted-unifrac analysis of bacterial community structure during vegetable fermentation

2.5 地方自然发酵蔬菜发酵过程中聚类分析

如图6所示，不同发酵时间的8 个样品在属分类水平的物种丰度相似性进行聚类分析。通过对颜色梯度及相似程度进行分析[20]，V0与其他样品差距较大，V3、V5、V6及V7基本接近，说明随着发酵蔬菜的成熟，样品之间的微生物差异性减少，物种丰度越来越相似。根据Alpha多样性、Simpson指数和Shannon指数显示V0的多样性 指数最高，V0中含量较多的属假单胞菌属（Pseudomonas）、地杆菌属（Geobacter）、泛菌属（Pantoea）、欧文氏菌属（Erwinia）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）和拉乌尔菌属（Raoultella）均属于变形菌门，环丝菌属（Brochothrix）、魏斯氏菌属（Weissella）和明串珠菌属（Leuconostoc）属于厚壁菌门。随着发酵时间的延长，样品菌属发生较大改变。发酵初期的乳球菌属（Lactococcus）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptoccus）和Fructobacillus等更丰富，变形菌门菌属减少，此阶段酸度下降，但变形菌门的存在使亚硝酸盐升高[21]，发酵中期的样品V4中含有棒杆菌属（Corynebacterium）、肠球菌（Enterococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）和微小杆菌属（Exiguobacterium）可能来自于外界污染。发酵后期，蔬菜样品的微生物多样性相对减少，主要含有乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）及真杆菌属（Eubacterium）[22]，均属于厚壁菌门。

图6 蔬菜发酵过程中聚类热图Fig. 6 Heat map from clustering during vegetable fermentation

3 讨 论

在蔬菜发酵过程中，蔬菜附着微生物与发酵液混合，随着发酵时间延长，乳酸菌为优势菌，其中会出现异型发酵乳酸菌和同型发酵乳酸菌交替和消长现象[23]，并代谢产生乳酸使酸度降低，发酵后期乳酸的积累使菌落总数下降。由于后期菌群结构较相似，乳酸菌数和酸度趋于平稳。前期加入老汤使发酵过程中乳酸菌及其代谢产物（有机酸）可以降解发酵蔬菜中的亚硝酸盐，因此在发酵过程中亚硝酸盐含量整体较低，燕平梅等[24]研究发现用泡菜老汤发酵蔬菜能够增强发酵系统中乳酸菌种群优势，形成有利于乳酸菌生长的环境。Jung等[25]通过焦磷酸分析研究韩国泡菜菌群结构，发现异型发酵乳酸菌是泡菜发酵过程的主要功能菌，可以提高产品风味。张庆芳等[26]发现发酵蔬菜中亚硝酸盐的降低，原因有两种：一为由微生物还原酶导致，二为微生物发酵过程产生有机酸引起，且酸度与亚硝酸盐的降解有很大关系，pH 4.0时可能是酶降解和酸降解的分界点。

采用高通量技术分析发现，样品发酵初期微生物组成差异较大，除未知菌属外，魏斯氏菌属和乳杆菌属为优势菌属。Jeong等[27]研究发现乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和魏斯氏菌属（Weissella）等在蔬菜发酵过程中起主要作用。佟婷婷等[28]通过宏基因组研究泡菜母水发酵蔬菜细菌微生物多样性的结果显示，泡菜发酵中启动菌为魏斯氏菌属，发酵的关键菌为乳杆菌属，与本研究结果一致，说明地方发酵蔬菜中魏斯氏菌属在发酵的初始阶段中起到重要作用。随着发酵的进行，乳杆菌属（Lactobacillus）成为发酵蔬菜中的绝对优势菌，与Kim[29]和张先琴[30]等研究结果一致。通过PCoA及聚类热图分析可进一步了解不同发酵蔬菜样品菌群结构差异。本研究对地方发酵蔬菜过程中样品，结合高通量技术和传统指标进行研究，发现细菌群落结构与发酵蔬菜的指标存在对应关系，对于后续实验功能菌的分纯、应用及对发酵蔬菜产品工业化推广提供指导性意见。

4 结 论

地方自然发酵蔬菜0～7 d的Shannon指数相差63%，随着发酵进行多样性越丰富。0 d主要菌属为魏斯氏菌属和明串珠菌属，所占比例分别为11.2%和9.9%，还包括假单胞菌属及肠杆菌属。5 d样品主要菌属为乳杆菌属，7 d时所占比例为93.5%，还包括片球菌属及真杆菌属，发酵后期菌群结构相似性较大。微生物数量和菌群均趋于稳定，酸度和亚硝酸盐含量稳定，发酵结束后（7 d）细菌总数和乳酸菌数分别为1.2×107CFU/g和2.5×106CFU/g，地方发酵蔬菜中的亚硝酸盐含量为0.15 mg/kg，发酵结束pH值为3.22，总酸含量为1.98 g/kg，乳酸菌数与亚硝酸盐呈彼消此长趋势。