王 惋，卢佳音，焦月华，王毅超，姜瞻梅，田 波，王玉堂，侯俊财,*

（1.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，黑龙江 哈尔滨 150040）

自然发酵酸菜的制作是利用微生物附着在蔬菜表面，从而进行自然发酵。蔬菜发酵的过程、酸菜制品的风味及品质直接受微生物活性的影响[1]。方心芳[2]指出虽然蔬菜的发酵由多种微生物参与，但是主要产酸的是乳酸菌。Fan Sicun等[3]研究了泡菜腌制中菌系的生长规律。乳酸菌的数量在新鲜蔬菜上比较少，但当条件适宜时，乳酸菌则会处于优势[4-5]。因为生成的乳酸不仅能使发酵环境的酸性变强从而抑制杂菌，而且对产品品质、风味具有重要的影响[6]。乳酸菌具有促进营养成分的分解、调节肠道菌群、抗菌、降低血清胆固醇、增强免疫力的益生作用[7-9]，在食品、医药和饲料等领域，乳酸菌也得到广泛应用。在食品工业中，乳酸菌具有抑制有害菌的生长、增强抗氧化剂的效果[10]；在医药行业中，乳酸菌可以调节肠道内的免疫反应，通过行使免疫功能抑制肠道发生炎症[11]；在饲料方面，含有乳酸菌的益生性饲料可以提高动物产量[12]。但是，外源乳酸菌要想在肠道中定植发挥作用，必须要能够耐受胃中的酸性环境[13]，因此，筛选具耐酸的乳酸菌具很大的研究和应用价值。与传统的生理生化鉴定方法相比，16S rDNA序列同源性分析技术作为一种分子水平鉴定技术，由于其简单易行、准确高效，近几年被广泛应用于乳酸菌种属鉴定[14]。

结合上述内容可以看出，在全面发展的背景下，乡村规划建设要充分满足当前农民发展的基本需求，同时还要保护好乡村地区固有的生态环境，提高乡村规划的科学性与合理性，并且还需在发展中充分结合乡村实际，有针对性地开展乡村规划工作，进而不断完善乡村规划的整体水平。

本研究拟从质量优良的酸菜汁样品中分离出乳酸菌菌株，利用形态学分析和随机扩增多态性DNA标记（random amplifiled polymorphism DNA，RAPD）分析技术，初步鉴定所分离的菌株类型，随后利用16S rDNA序列同源性分析，以确定分离菌株的分类学地位，并筛选耐酸性菌株，最后对未确定分类学地位的高耐酸性菌株的管家基因rpoA的同源性进行分析，为其进一步深入开发应用研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自然发酵酸菜汁样品采集自黑龙江省齐齐哈尔市周边地区的10 家农户。向MRS固体培养基[15]中加入2% CaCO3制成选择培养基，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

TGL-16B型高速离心机 上海市离心机械研究所有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；L2型紫外-可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；MiniCyclerTM型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 美国MJ Reserarch公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

将农户自然发酵的酸菜在其发酵容器中充分搅样混匀后，用灭菌移液器吸取酸菜汁转移至灭菌采样瓶中，随后将采样瓶置于冰盒内，快速转放到实验室冰箱内低温冻藏。10 份样品均用传统方法自然发酵、风味良好、处于发酵后期的酸菜汁。

1.3.2 乳酸菌的分离纯化

根据张鲁冀等[16]的方法取适量样品，将样品用质量分数为0.9%的生理盐水，按照10 倍逐渐递增的方法进行稀释。依次选择稀释度为10－4～10－7的3 个样品各200 μL，涂布于选择培养基，每个稀释度做3 个平行实验，37 ℃的环境下，经36～48 h培养后观察。将产生溶钙圈的菌落单独选取出来进行镜检，细菌细胞形态以及排列方式基本相同的菌落确定为纯菌株。若菌落不纯，则将菌落重新划线、接种、培养，到菌落分纯为止。然后将进行过氧化氢酶实验的纯菌株的形态记录并编号，随后进行革兰氏染色和镜检，采用体积分数20%的甘油进行保护，于－20 ℃进行保藏[17]。

基于RAPD的结果，采用PCR扩增同一样本中基因型不同菌株的16S rRNA基因序列，扩增体系和反应条件参照李欣等[20]的方法。PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳后在紫外灯下观察扩增条带。随后将PCR扩增产物送至华大公司进行测序。在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，通过BLAST，将分离菌株的16S rDNA序列与GenBank进行同源性比较，将与目的基因序列同源性最高的序列筛选出来，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树，完成菌种鉴定。

RAPD技术是利用随机引物通过PCR，非定点扩增DNA片段，然后通过观察扩增片段的多态性来对分离菌株进行基因分型[18]。提取分离菌株的基因组DNA，按照Antara等[19]的方法对72 株分离菌株进行基因分型，RAPD的引物和扩增条件如下，扩增体系见表1。

引物4：5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’。PCR扩增条件：第1步：94 ℃预变性5 min；第2步：94 ℃变性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行40 个循环；第3步：72 ℃、5 min的PCR扩增条件。

2.1.1 样品中乳酸菌的分离

引物1：5’-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3’；引物2：5’-NNNAACAGCTATGACCATG-3’。PCR扩增条件：第1步：94 ℃变性5 min，42 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，进行4 个循环；第2步：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行30 个循环；第3步：72 ℃、5 min。

大理市是大理白族自治州州府所在地，位于滇西中部，地处东经99°58′～100°27′，北纬25°25′～25°58′，东连宾川和祥云2县，南邻弥渡和巍山两县，西接漾濞县，北临洱源县，距省会昆明市约338 km。大理市境东西横距46.3 km，南北纵距59.3 km，国土面积1 815.00 km2，总体位于洱海流域范围以内。现辖下关镇、大理镇、凤仪镇、喜洲镇、挖色镇、海东镇、银桥镇、湾桥镇、双廊镇、上关镇和太邑乡10镇1乡，以及大理省级旅游度假区和大理国家级经济开发区(图1)。

表1 PCR扩增体系Table 1 PCR amplification system

在配制的1%的琼脂糖凝胶中，分别加入4 种引物的PCR扩增产物，电压100 V，电泳1 h，在紫外灯下进行观察分析，并记录结果。然后将DNA指纹图谱的变化情况进行比对分析。

社区获得性肺炎是呼吸系统常见的一种疾病，主要是由病原菌感染引起，常见的病原菌主要有结核杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌等［6］。研究发现，社区获得性肺炎发病机制主要是因为:病原体大量聚集，造成了局部的感染，病原体也可以为呼吸道的正常菌毒性加强转变而来，其聚集的途径主要是通过空气、血液以及呼吸道相关菌的误吸等，患者呼吸道和自身免疫系统功能降低，对病原菌和病毒的抵抗能力减退而发病［7－8］。刘婧［9］指出社区获得性肺炎患者发病后，抗凝血酶-Ⅲ和纤维蛋白原出现了紊乱，说明社区获得性肺炎患者病情发展可能和凝血功能指标有关。。

1.3.4 菌株的16S rRNA基因同源性分析和系统发育树构建

1.3.3 RAPD分析

1.3.5 酸耐受性菌株的筛选

将PCR产物送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。序列与GenBank中已知菌株的rpoA基因序列进行同源性分析，随后用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

(1) 由于电机有较大幅度增容要求，冷却器结构体积需有较大增加，已不适应原有的坑道面积，所以适合改为背包式安装型式；

参照刘宏宇等[21]的方法，将供试菌株传代2 次，将其接种至MRS培养基中，接种量为2%，37 ℃条件下培养14～16 h，离心去上清液，加入pH值为3.0的生理盐水制成适宜浓度的菌悬液。迅速挑取少量的菌悬液，进行稀释，选取两个最合适的稀释度，分别在MRS琼脂平板上涂布，在37 ℃条件下培养48 h，进行活菌计数，此时得到的活菌数就是0 h的起始数据。将剩余菌悬液放置于37 ℃恒温培养箱孵育2 h，用相同的方法进行菌落计数，计算存活率。

综上所述，MCN-IC总体发病率较低，年龄≥60岁、腹痛、CA19-9≥37 U/ml、病灶边界不清、壁结节和无分隔预示MCN-IC的可能，宜尽快手术治疗。如无以上危险因素，则MCN-nIC的可能性更大，进行随访或非手术治疗是可行的。

模板为各菌株的基因组DNA，将其管家基因RNA聚合酶α-亚基基因进行扩增，引物序列和退火温度见表2。

表2 管家基因的引物序列及PCR的退火温度Table 2 Primer sequences for house-keeping genes and PCR annealing temperatures

1 μL模板DNA，1 μL引物，25 μL 2×TaqMaster Mix，22 μL无菌蒸馏水的50 μL PCR体系。第1步：95 ℃预热5 min；第2步：95 ℃变性1 min，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸65 s，进行3 个循环；第3步：95 ℃变性35 s。退火75 s，72 ℃延伸65 s，进行30 个循环；第4步：72 ℃延伸7 min[22-23]。

待汪队长的怒气发泄完了，他才使出三寸不烂之舌，从以人为本的高度讲到人的本能，讲到战场纪律的严肃性和灵活性，从战前的渴求讲到牺牲后的不留遗憾，一直讲得汪队长无话可说。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与菌株形态

引物3：5’-CCGCAGCCAA-3’。PCR扩增条件：第1步：94 ℃变性5 min，36 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，进行4 个循环；第2步：94 ℃变性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行30 个循环；第3步：72 ℃、5 min。

将采集的10 份样品分别稀释涂布，再经反复划线纯化，分离出在含2% CaCO3的MRS培养基上有溶钙圈的菌株，其中有72 株革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌，初步确定其为乳酸菌。

浇水时掌握五浇五不浇，即晴天浇水，阴天不浇水；上午浇水，下午不浇水；浇温水，不浇冷水；膜下浇暗水，不浇明水；要浇轻水，不浇大水，并注意浇水后放风排湿。

2.1.2 乳酸菌菌株的形态学特性

1.3.6 筛选菌株管家基因rpoA的序列同源性分析和系统发育树构建

从10 份农家酸菜汁样品中分离得到72 株乳酸菌。琼脂培养基上的菌落形态、革兰氏染色后显微镜下的菌体形态描述详见表3。

表3 乳酸菌分离株菌落形态及显微镜下的菌体形态Table 3 Colonial morphology and microscopic morphology of LAB isolates

由表3可知，在10 份农家酸菜汁样品中分离得到乳酸菌菌株中，62 株分离菌株为乳酸菌杆菌，占所分离菌株的86%以上，为优势菌，丛敏等[24]也发现，在发酵第40天的东北传统发酵酸菜中含有丰富的乳酸菌，主要优势菌群为乳杆菌属的菌株。这是由于所采集样品为发酵后期的酸菜汁，pH值几乎已经达到发酵最低点，一般来说，乳杆菌的酸耐受性要好于乳酸球菌，所以，在发酵后期的酸菜汁中乳杆菌为优势菌群。其余10 株分离到的乳酸菌菌株可能为肠球菌，因为总的来说，在乳酸菌中肠球菌属菌株的酸耐受性也很强，仍需要进一步的鉴定，武俊瑞[25]也在采用传统方法自然发酵成熟的酸菜发酵液中分离到少量肠球菌，约占所分离菌株的12%。

在侦查决策过程中，为了实现侦查目的，人们往往追求最优决策，进而根据最优决策来实施侦查行为。所谓最优决策，是指从全部可行方案中选出的能实现目标的最优方案。但是侦查所面对的是复杂多变的刑事案件，且在侦查过程中存在着侦查人员与犯罪分子之间的活力对抗，因而侦查最优决策往往很难实现，因而侦查决策大多数属于一种满意原则下的决策。

2.2 乳酸菌的初步鉴定

2.2.1 RAPD分析

根据菌株的菌落表型及细胞形态，选取34 株菌落表型及细胞形态差异较大的菌株进行RAPD分析。4 种引物的扩增产物电泳后，在紫外灯下观察，供试菌株的DNA指纹图谱如图1所示。

图1 不同乳酸菌的RAPD-PCR指纹图谱Fig. 1 RAPD-PCR fingerprinting patterns for LAB strains

由图1A引物1扩增得到的指纹图谱可见，菌株26#和36#为同型，菌株49#和59#为同型，菌株66#和54#为同型。由图1B引物2扩增得到的指纹图谱可见，菌株11#和17#为同型，菌株34#、26#、55#、68#和36#为同型，菌株52#、59#、66#、49#和54#为同型，菌株35#、22#和30#为同型。由图1C引物3扩增得到的指纹图谱可见，菌株11#和17#为同型，菌株49#、52#和59#为同型，菌株66#和54#为同型，菌株22#和47#为同型。由图1D引物4扩增得到的指纹图谱可见，菌株11#和17#为同型，菌株43#和67#为同型，菌株26#和36#为同型。

行政事业单位的内部控制体制应该以《行政事业单位内部控制规范 (试行)》为核心依据，结合各单位的实际发展和员工构成情况，从每个细节入手，全面落实内部控制的各项内容。首先，单位应该建立内部控制标准，通过这个标准的约束力实施检测员工的工作情况和部门的运行情况，在整个行政事业单位实行体制化的管理模式。科学的内部控制管理体系应该遵循我国当前经济发展的状况，把握国家政策方针，以培养员工积极性和内控意识为出发点，按照当今环境的需求进行改革工作。

综上所述，通过4 种引物的扩增产物的电泳图分析比较并结合菌株分离时的生长活力，挑选出21 株指纹图谱不相同的菌株进行16s rRNA鉴定，21 株乳酸菌分别为：菌株8#、11#、16#、19#、20#、22#、32#、34#、41#、43#、44#、46#、48#、53#、56#、59#、60#、62#、63#、71#、72#。

截至17日上午，青海省水利厅派出的2批13支供水工程应急抢险救灾小分队共220余人，全部到达抗震救灾第一线，并有针对性地开展工作，累计提供的救灾物资折合人民币达到500万元。4月17日，青海省水利厅订购的生命吸管有400套运往灾区。

2.2.2 分离菌株的16S rRNA基因同源性分析及系统发育树构建

21 株疑似乳酸菌基因组PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。可以看出，21 条目的片段都在1 500 bp左右，且条带清晰。

将扩增产物测定所得序列通过BLAST与GenBank数据库中已知菌株序列进行比对，用MEGA 6.0软件进行序列分析，构建系统发育树（图3）。

怀孕后准妈妈要做很多种检查，这些检查分为常规检查和特殊检查，各种预防出生缺陷的高危筛查就属于特殊检查。出生缺陷是指婴儿出生前在母体子宫里发生的发育异常以及身体某些部位存在的畸形，例如无脑儿、脑脊膜膨出、呆小症、兔唇、先天性心脏病、先天愚型等，其中最主要的是预防先天性疾病和遗传性疾病，唐氏综合征就是其中最重要的一种。

已有研究表明，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌等是泡菜中发挥优良作用的乳酸菌种类[26]。本研究中，根据同源性检索分析并结合系统发育树中21 株乳酸菌的分类学位置，确定在分离得到的21 株乳酸菌中，15 株菌为乳杆菌，6 株为肠球菌。其中菌株8#为乳肠球菌（Enterococcus lactis），菌株11#、16#、19#和60#为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus），菌株20#为米曲霉乳杆菌（L. oryzae），菌株22#、34#和62#为短乳杆菌（L. brevis），菌株32#、53#和63#为副干酪乳杆菌（L. paracasei），菌株41#和72#为棒状乳杆菌（L. coryniformis）。由于植物乳杆菌（L. plantarum）JCM 1149和戊糖乳杆菌（L. pentosus）ATCC8041的16S rDNA序列同源性大于99%，通过16S rDNA序列分析无法确定菌株43#、56#和59#的分类学地位，仅能确定菌株43#、56#和59#都属于乳杆菌。而E. gilvus ATCC BAA-350、E. avium ATCC 14025、E. raffinosus NCIMB 12901和E. malodoratus LMG 10747之间的16S rDNA序列同源性也大于99%，因此菌株44#、46#、48#和71#仅能确定都属于肠球菌，需进一步的鉴定实验才能确定其具体的分类学地位。但是，刘晓辉等[27]研究发现，泡菜中不仅能分离出乳杆菌，还分离出了肠膜明串珠菌。这是因为在泡菜发酵过程中，每个时间段的微生物比例有所不同，由于酸菜样品采集的时间不同，该时间段的优势菌种也不同[28]。

图2 乳酸菌16S rRNA基因扩增电泳图Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR amplified 16S rRNA gene from lactic acid bacteria

图3 乳酸菌16S rRNA基因序列的遗传进化树分析Fig. 3 Phylogenetic tree of Lactobacillus based on 16S rRNA gene sequences

2.3 乳酸菌酸耐受性结果

从表4可以看出，21 株受试乳酸菌在pH 3.0的环境中孵育2 h后，其存活率差异较大，从25.3%～99.1%不等。其中存活率在75%以上的乳酸菌有8 株，分别是菌株8#、11#、16#、53#、56#、59#、60#、62#。菌株53#、59#、62#三株菌的存活率在90%以上，其中59#的存活率达到了99%以上，耐酸性最好。这与Huang[29]和Millette[30]等的研究结果一致，不但不同乳酸菌菌种的酸耐受性之间有差异，而且相同菌种的不同菌株之间的酸耐受性差异也非常大。

表4 pH 3.0对乳酸菌存活率的影响Table 4 Survival rate of LAB strain at pH 3.0%

2.4 筛选菌株的rpoA基因同源性分析

由于仅凭16S rDNA序列分析无法确定筛选的耐酸性菌株中56#和59#的分类学地位，因此为了将来菌株56#和59#在食品工业中的应用，还需要进一步的实验来确定它们的分类学地位，本研究进行了管家基因rpoA的同源性分析。筛选菌株56#和59#的管家基因rpoA系统发育树见图4。

图4 乳酸菌rpoA序列的系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of L. curvatus based on rpoA sequences

菌株56#与L. paraplantarumLMG 16673T的rpoA基因序列同源性为99.6%，结合图4系统发育树中它们相应的系统发育位置，确定菌株56#为L. paraplantarum，菌株59#和菌株L. plantarumsubsp.plantarumLMG 6907和L. arizonensisLMG 19807的rpoA基因序列同源性分别为100%和99.3%，因此，结合图4系统发育树中其相应的系统发育位置，确定菌株59#是植物乳杆菌植物亚种（L. plantarumsubsp.plantarum）。与李欣等[20]的研究结果相比，本研究的结果更加准确完善。因为一般利用传统的16S rDNA分子生物学鉴定方法和生理生化特征可以将乳酸菌菌株鉴定到种的水平，但无法准确鉴定L. plantarum和L. pentosus。随着微生物分类学技术的不断进步，新的乳酸菌菌种不断被发现，近年来管家基因被用来在种的水平上鉴别乳酸菌菌株，是用于鉴定争议菌株的有力工具，具有快速简便、重复性好、高区分力的特点，是检测物种最有效的方法[23]。本研究进一步利用管家基因rpoA的同源性分析和构建系统发育树的方法来准确的确定筛选菌株56#和59#的分类学地位。

3 结 论

从传统酸菜汁中分离得到的72 株乳酸菌中包括62 株乳杆菌和10 株乳球菌，其中21 株乳酸菌的指纹图谱不相同。16S rDNA序列同源性分析和系统发育树可以鉴定出有1 株乳肠球菌，4 株弯曲乳杆菌，1 株米曲霉乳杆菌，3 株短乳杆菌，3 株副干酪乳杆菌，2 株棒状乳杆菌，剩余3 株为乳杆菌，4 株为肠球菌。21 株乳酸菌菌株中有8 株菌的耐酸性较好，在pH 3.0条件下存活率在75%以上，其中3 株的耐酸性最好，存活率达到90%以上；进一步的管家基因rpoA序列同源性分析，确定筛选出的两株强耐酸性菌株分别为L. paraplantarum和L. plantarumsubsp.plantarum。本研究筛选出的耐酸性乳酸菌菌株均来自传统自然发酵的酸菜，通过16S rDNA序列和管家基因同源性分析及构建系统发育树精确地确定了它们的分类学地位，为其进一步开发应用提供理论基础。