霍 超，卢海强，刘晓宇，李 琪，高 洁，桑亚新*

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）属于黄曲霉毒素类化合物，基本结构为一个羟基取代基的二呋喃环与一个氧杂萘邻酮[1]。奶牛食用黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染饲料后，肝脏中的P450细胞色素酶将AFB1代谢成AFM1并分泌到牛奶中。人们饮用这种牛奶后，会对健康构成巨大威胁[2]，乳制品的AFM1污染在全球多地已有报道[3]，解决乳制品中AFM1污染的问题刻不容缓。

降低AFM1污染的方法有化学法、物理法和生物法，其中生物法是公认的绿色、高效的脱毒方法[4]。已报道的生物脱毒法将乳酸菌或其他微生物直接加入食品中，抑制食品加工贮藏过程中的霉菌生长，可以降低黄曲霉毒素的污染风险[5]；酶制剂直接降解黄曲霉毒素，已报道的有黄曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶[6-7]，通过降解饲料中的AFB1来降低动物性食品中的AFM1[8]；通过微生物的吸附作用减少黄曲霉毒素含量，牛奶中加入鼠李糖乳杆菌能够降低AFM1含量[9]。国内对黄曲霉毒素降解菌处于筛选阶段，缺乏进一步研究，黄曲霉毒素降解酶基因公布较少、适用性不强，给降解酶机理的研究和食品行业应用带来困难[10]。

为通过生物手段脱除AFM1，本实验室通过筛选得到1 株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus E-1-1-1），其胞外酶可以降解AFM1，降解率可达92.5%[11]，并进行了纯化等研究，在AFM1的酶法降解中取得了一定的成果。CotA漆酶是一种从芽孢杆菌孢子层中分离的蛋白质，含有3 个Cu2+结构域，能够氧化多数真菌漆酶底物[12]，漆酶是一种含Cu的多酚氧化酶，含有多个Cu2+结构域，可以通过O-Cu间的电子传递形成高电位，对多环芳香族有很好的降解作用[13]。据报道，漆酶具备有效降解AFB1的能力[14]，而对于AFM1的研究鲜有报道。

本研究对B. pumilus E-1-1-1来源的cotA基因克隆表达，并对重组酶的酶学性质进行表征，进一步探究了CotA漆酶在AFM1降解中的潜力，这为生物法降解AFM1提供了新的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

B. pumilus E-1-1-1、Escherichia coli（BL21）、表达载体pET-30a（+）和SMMC-7721肝癌细胞均为本实验室保存。

pEASY-T1克隆试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂，限制性内切酶EcoRI、NotI，T4 DNA连接酶宝生物工程（大连）有限公司；蛋白提取试剂盒、Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒 康为世纪生物科技有限公司；AFM1酶联免疫试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；RPMI-1640培养基 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为市售分析纯，引物合成和核酸测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

TGL 16M高速台式离心机 湖南易达公司；Tprofessional PCR仪 德国Biometra公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；JY04S-3E型凝胶成像系统北京君意东方电泳设备有限公司；1260高效液相色谱仪（配有荧光检测器） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆及生物信息学分析

B. pumilus E-1-1-1接种于LB培养基中，37 ℃培养24 h，离心收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，获得B. pumilus E-1-1-1总基因组DNA。

参考已报道B. pumilus SH-b9 cotA基因（登录号为UP12_RS03245）序列信息设计表达引物：cotA-PF：5’-CGAATTCCATCATATATAGATATTGTTGGAGA GC-3’（下划线为EcoRI酶切位点）；cotA-PR：5’-AATG CGGCCGCTTATATCCATCGGCCG-3’（下划线为NotI酶切位点）。

以B. pumilus E-1-1-1基因组作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30 个循环；72 ℃、10 min。扩增产物参照快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，切胶回收后与pEASY-T1载体连接构建pEASY-T1-cotA质粒。转入Trans1-T1感受态细胞，并通过筛选获得阳性转化子。将阳性转化子交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，分析测序基因序列，将含阳性基因序列的质粒进行后续实验。

依据cotA基因的测序结果，使用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析潜在信号肽剪切位点。使用NCBI的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行相似性比对，使用Clustalx软件将该序列与其他来源的漆酶序列进行保守序列分析。利用ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）预测CotA蛋白的分子质量和等电点。

1.3.2 表达载体的构建及诱导表达

使用EcoRI和NotI双酶切处理pEASY-T1-cotA和pET-30a（+），使用胶回收试剂盒对目的酶切产物进行回收，使用T4 DNA连接酶进行cotA和pET-30a（+）的连接反应，得到重组表达载体pET-30a-cotA，转化E. coli（DE3）表达菌株中，采用菌液PCR扩增目的片段鉴定阳性克隆子，并将阳性克隆子交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，对测序正确的菌株进行诱导表达。含pET-30a-cotA的BL21接入含卡那霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min过夜活化。次日以1%接种量转接,菌液OD600nm达到0.8后，加入异丙基硫代半乳糖苷终浓度0.5 mmol/L和CuSO4终浓度5 mmol/L，于22 ℃恒温培养14 h，测定细胞破碎液的漆酶活力。

1.3.3 重组漆酶的纯化

含重组质粒的E. coli（DE3）菌株，经诱导表达后，5 000 r/min离心10 min收集菌体。向收集到的菌体中加入蛋白质抽提试剂，置于室温反应15 min，冰水浴超声10 次，每次12 s，10 000 r/min离心5 min去除细胞碎片，收集上清液使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测，收获的上清液加入镍柱纯化，使用不同咪唑浓度浓度的洗脱液NTA-20、NTA-80和NTA-200洗脱重组漆酶[10]，分别收集不同浓度的洗脱液，对各洗脱液进行漆酶活力测定。

1.3.4 漆酶活力的测定

使用50 μL的酶液与150 μL 5 mmol/L的2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）混合，反应1 min后立即沸水浴5 min，测定420 nm波长处吸光度，ABTS的氧化导致420 nm波长处的吸光度增加（ε=36 000 L/（mol·cm））。一个酶活力单位定义为每毫克蛋白每分钟氧化1 μmol底物的酶量[15]。酶活力计算如式（1）所示：

式中：A为420 nm波长处的吸光度；V为溶液总体积/μL；ε为摩尔吸光系数；t为反应时间/min；V0为加入漆酶体积/μL。

1.3.5 重组酶酶学性质分析

1.3.5.1 最适温度和最适pH值测定

将纯化的酶液加入pH 4.5缓冲溶液中，分别在20～90 ℃（每10 ℃为1 个梯度）放置1 min后测定漆酶活力，确定重组漆酶的最适反应温度。将酶液置于不同pH值（3.0～10.0）缓冲液并在最适温度下进行酶促反应，测定酶活力确定重组漆酶的最适pH值。

1.3.5.2 温度稳定性和pH值稳定性测定

将纯化的酶液在40、50、60 ℃条件下分别处理0、2、4、6 h和8 h，按标准酶活力测定方法测定各条件下残余酶活力确定重组漆酶的温度稳定性。同时将纯化的酶液置于缓冲液（pH 5、pH 7和pH 9）中，冰上放置0、2、4、6 h和8 h，按标准酶活力测定方法测定各条件下残余酶活力确定pH值稳定性。

1.3.5.3 化学试剂和不同金属离子对酶活力的影响

将纯化的酶液分别添加浓度均为10 mmol/L的金属离子（K+、Na+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+）、SDS和体积分数10%有机试剂（甲醇、乙醇和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）），测定各条件下的漆酶活力。

样品破碎和锆石挑选由廊坊峰之源矿物分选技术服务公司完成。样品经破碎后，人工淘洗保留重砂部分。对重砂部分进行电磁分选和重液分选，得到一定纯度的锆石样品，然后在双目镜下人工挑选出晶形完好、透明度高、无裂纹的锆石晶体。制靶时，将待测样品与标准样品TEM同时放置。磨蚀和抛光树脂靶，直至锆石核心部位暴露再进行阴极发光显微照相，阴极发光图像在中国地质科学院矿产资源研究所电子探针实验室拍摄，并结合透射光和反射光图像观察锆石内部结构。

1.3.5.4 Km和Vmax测定

选用不同浓度的ABTS（1、2、3、4、5 mol/L）缓冲液作底物，在最适温度和最适pH值缓冲液条件下测定酶活力，使用米氏方程双倒数法求得Km及Vmax值[16]。

1.3.6 重组漆酶降解AFM1能力的测定

配制AFM1质量浓度为400 μg/L的牛奶，加入1 U/mg的CotA漆酶，分别在37 ℃、中性条件下反应24、48、72 h，参照说明书使用AFM1酶联免疫试剂盒测定AFM1的残留含量，实验进行3 次测定，取平均值。降解率计算如式（2）所示：

式中：A为AFM1初始质量浓度；B为反应后AFM1的质量浓度。

1.3.7 降解产物的毒性分析

质量浓度400 μg/L的AFM1溶液加入1 U/mg的CotA漆酶，分别在37 ℃条件下反应24、48 h和72 h，作为样品组保存在－20 ℃处待测，以不含AFM1的CotA漆酶和质量浓度400 μg/L的AFM1溶液作为空白对照和阳性对照。将样品解冻后加入到10 mL终止液中（甲醇-水体积比30∶70），加入5 mL氯仿，冰水浴超声萃取15 min，使用分液漏斗收集下层氯仿，重复3 次[17]。将收集所得的氯仿蒸干，使用1640培养液复溶，制成不同时间的降解产物培养液。

使用加入10%小牛血清的1640培养液与SMMC-7721肝癌细胞混匀，将混匀液转到细胞培养瓶中，5% CO2，37 ℃培养。当SMMC-7721细胞数量达到4×108个/mL，取100 μL细胞培养物和100 μL不同时间的降解产物培养液加入96 孔板中，将96 孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中48 h，在终止培养前4 h，各孔添加5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）10 μL，置于CO2培养箱继续培养4 h后，加入90 μL甲瓒溶解剂（14% SDS+50% N,N-二甲基甲酰胺）培养过夜，混匀后测其570 nm处的吸光度[18]。

1.4 数据分析及处理

每次实验平行测定3 次，利用SPSS 19.0软件对结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

使用cotA-PF、cotA-PR为引物，以B. pumilus E-1-1-1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的特异性条带与pEASY-T1载体连接构建pEASY-T1-cotA质粒，质粒转入Trans1-T1感受态细胞后对阳性克隆子进行测序。分析测序结果得到B. pumilus E-1-1-1来源的cotA基因长度为1 486 bp，编码495 个氨基酸，不含信号肽，相对分子质量约58 kDa，理论等电点为5.94。使用Clustal软件将翻译后的氨基酸序列（E-1-1-1 CotA）与细菌漆酶的氨基酸序列进行多序列比对，结果显示与B. pumilus序列AFV60743.2O同源性最高，为96%；与红毛栓菌AAB47735.2同源性为46%。将cotA漆酶基因与5 个细菌漆酶和1 个真菌漆酶序列进行比对，保守氨基酸残基如图1所示。细菌漆酶蛋白与4 个Cu2+结合位点的12 个氨基酸非常保守，这些高度相似的氨基酸残基构成细菌漆酶中4 个相对保守的氨基酸序列。

图1 漆酶氨基酸序列比对Fig. 1 Alignment of laccase amino acid sequences

2.2 CotA漆酶的表达及纯化

图2 重组CotA漆酶SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant CotA laccase

对质粒pEASY-T1-cotA和pET-30a（+）进行双酶切，使用T4 DNA连接酶连接双酶切产物，热激转化E. coli（DE3），构建重组质粒pET-30a-cotA，阳性克隆经测序后，结果正确。用构建好的pET-30a-cotA重组表达载体，在E. coli（DE3）中采用低温诱导法进行表达活力达到367 U/L。同时，蛋白抽提试剂盒得到的可溶性蛋白经亲和层析纯化，收集不同浓度的洗脱液，经SDSPAGE检测，在58 kDa处出现目的蛋白条带（图2）。

2.3 CotA漆酶酶学性质的表征

图3 温度和pH值对重组CotA漆酶活力的影响Fig. 3 Effects of temperature and pH on the activity of recombinant CotA laccase

由图3A、B可知，CotA漆酶最适温度为40 ℃，在40～60 ℃温度范围内，酶的相对活性可达70%以上。然而，超出60 ℃以后CotA漆酶活力急剧下降，表明重组漆酶在高温下快速变性，70 ℃时剩余活力为34.1%，80 ℃时完全消失。漆酶的最适反应温度一般较高（40～70 ℃），如密孔菌L3漆酶最适反应温度为55～75 ℃[20]；云芝漆酶最适反应温度为85 ℃[20]。在40 ℃条件下漆酶CotA漆酶的活性很稳定8 h内无明显变化，但随着温度升高至60 ℃，6 h后CotA漆酶的剩余活力为48%。离开了孢子结构，漆酶经重组表达后的稳定性降低，如枯草芽孢杆菌WD23漆酶接近温度范围（40～90 ℃）在pH 7.0时高度稳定，经重组表达后热稳定性出现明显降低[21]。

由图3C、D可知，在pH 4时酶活力最高。另外，pH值在4～8范围内具有明显的活性，其活性均保持在50%以上，但是超出此范围后酶的漆酶活力均大幅降低。根据已报道的研究，CotA漆酶是一种酸性酶，最适pH值大多在酸性范围内，B. pumilusW3CotA、B. pumilusDSM 27漆酶的最适pH值为4.5[22-23]，在此pH值范围内的其他细菌漆酶也表现出较高的活力；大部分真菌漆酶最适pH值为2～5，少部分最适pH值为中性[24]。经过重组后的漆酶在中性和酸性条件下表现出良好的耐受性半衰期均大于8 h，在pH值为9的条件下其半衰期为8 h。大部分漆酶在中性和中性偏碱的条件（pH 6～10）能够稳定保存[25]。结果表明细菌CotA漆酶比真菌漆酶有更好的酸碱适用性。

表1 金属离子和有机试剂对CotA漆酶活力的影响Table 1 Effects of metal ions and organic reagents on recombinant CotA laccase activity

由表1可知，SDS、K+、Na+、Ca2+、乙醇和甲醇都会降低CotA漆酶活力；Cu2+、Mn2+、Zn2+、DMSO可以提高CotA漆酶活力。其中SDS对CotA漆酶活力抑制最强，10 mol/L下活力降低了95.7%；Mn2+对CotA漆酶活力提高最多，10 mol/L下活性提高33.0%。在细菌来源的漆酶中加入Na+会导致蛋白质变性，从而影响其活性，CotA漆酶受Na+的影响较小下降了13.6%，在某些嗜盐细菌中获得的漆酶也表现出相似的性质[26]。高浓度有机试剂抑制了CotA漆酶活力，在10%甲醇和乙醇溶液中保持了35.5%和67.2%的相对活力，在10% DMSO溶液中活力则有所上升。CotA漆酶活力随着10 mmol/L CuSO4的添加而达到125.3%。Cu2+的加入一般会使漆酶活力出现大幅度的提升[27]，由于本实验最终将应用放在食品工业上，所以不会额外添加Cu2+增加CotA漆酶活力，因为这样会提高Cu2+二次污染的风险。

动力学曲线回归方程为y=3.794x+1.257 6，R2＝0.993 5，该曲线拟合良好，可以作为反应动力学参数计算的方程模型。由回归方程可计算得：Km为3.01 mmol/L，Vmax为0.795 mmol/（L·min）。

2.4 CotA漆酶降解AFM1能力

图4 时间对CotA漆酶降解AAFM1的影响Fig. 4 Effect of contact time on CotA degradation of AFM1

如图4所示，将人工污染牛奶与CotA漆酶37 ℃贮存72 h后，AFM1的降解率为54.3%。以72 h作为降解AFM1的终点，是由于在已报道的生物降解黄曲霉毒素研究中降解终点的时间设置上有很大不同，但细菌降解时间3 d（28～37 ℃），真菌降解时间7 d（25～30 ℃）为较普遍条件[28]。本实验所得出CotA漆酶的AFM1降解率与AFB1降解率（降解率为74%）相比有较大差异，可能是由于AFM1与AFB1结构不同，也有可能是由于牛奶中丰富的蛋白质含量干扰了CotA漆酶对AFM1的脱除。Guimarães等[29]发现乳酸菌的加入对牛奶中的AFM1含量没有影响，推测在牛奶中乳酸菌脱除AFM1的能力可能会受到提取程序、毒素浓度、分析时间、贮存温度等多方面的影响；有结果表明，pH值的降低与相应黄曲霉毒素含量的下降呈正比关系，pH值降低越多，漆酶活力越强，黄曲霉毒素的含量下降越大。从降解效果上看，CotA漆酶可以作为一种AFM1生物脱毒手段应用到牛奶脱毒中。

2.5 不同时间降解产物的毒性分析

通过M T T法，得到A F M1对人肝癌细胞株SMMC-7721的存活率影响，1 μg/mL AFM1对SMMC-7721细胞的杀伤率最高，存活率为32.87%；0～100 ng/mL AFM1对SMMC-7721细胞影响不大。以不同质量浓度下AFM1对应的SMMC-7721细胞存活率进行回归计算，得到对细胞产生抑制的IC15为400 μg/L。

图5 AFM1经CotA漆酶脱毒后对SMMC-7721细胞存活率的影响Fig. 5 Effect of AFM1 detoxi fication by CotA laccase on the survival rate of SMMC-7721 cells

将不同时间下AFM1的降解产物与SMMC-7721肝癌细胞混合，如图5所示，使用CotA漆酶处理24 h后细胞存活率由AFM1对照组的81.5%上升到87.0%，72 h后上升到93.6%。AFM1细胞毒性的主导机制是DNA氧化损伤，其相互作用取决于细胞接触的AFM1浓度，在较高质量浓度下，AFM1由于其亲脂结构很容易被结合到细胞膜上，并以协同的方式发挥其细胞毒性[30]。在CotA漆酶作用下AFM1对肝癌细胞的毒性减小说明AFM1浓度降低，同时证明CotA漆酶能够有效脱除AFM1。

3 结 论

对黄曲毒素解毒cotA基因进行异源表达，继而获得高活性的黄曲毒素降解酶，是生物法降解黄曲霉毒素的重要研究方向。本研究从B. pumilus E-1-1-1中克隆得到总长为1 486 bp的cotA漆酶基因，并使用大肠杆菌成功表达，纯化获得的CotA漆酶蛋白最适温度为40 ℃，最适pH值为4，60 ℃半衰期为6 h，pH 9条件下半衰期为8 h，对有机溶剂和NaCl具有相当大的耐受性。CotA漆酶对牛奶中的AFM1有很强的降解效果，降解率达54.3%，降解产物毒性显著降低。实验结果证明生物酶CotA可以有效降解AFM1并且不会产生其他有毒物质。目前，CotA漆酶还需要继续进行基因优化，进一步提升该酶的应用潜力。