李进红，操丽丽，庞 敏，潘丽军，侯志刚，水龙龙，鲍 赛，姜绍通*

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009）

磷脂广泛存在于植物油脂中，随着植物油存放时间的延长，会使油脂变得不稳定，促使氧化酸败加剧，颜色加深[1]，增加过滤和操作的难度，造成设备结焦、脱色脱酸效果不佳、炼耗和辅助剂的用量增大等问题。因此菜籽油的脱磷对精炼工艺变得尤为重要[2-4]。随着对菜籽油品质的要求提高以及节能环保的理念增强，酶法脱胶具有广阔的研究前景[5-6]。磷脂酶主要包括磷脂酶A1、A2、B、C和D，它们能够特异性水解磷脂内部酯键，生成对应的溶血磷脂和脂肪酸。溶血磷脂具有良好的水分散性，易在水化工艺阶段去除[7-8]。磷脂酶A1热稳定性良好，酶活力高，反应稳定，适合用于科学研究和工业应用[9]。磷脂酶具有高效性和高度专一性，应用于油脂脱胶中具有反应条件温和、耗能低，几乎不会产生废水的优点。

固定化酶的方法和材料丰富多样，随着绿色发展的脚步加快，经济环保的材料成为科学研究的热门话题。水龙龙[10]、刘倩倩[11]等以离子交换树脂吸附固定化磷脂酶。以大孔树脂固定化酶会随着反应次数的增加，底物和产物的积累，使传质阻力增加，反应效率降低。经物理吸附的固定化酶结合稳定性差，造成酶较易泄露。陈丽萍[12]、占剑峰[13]等以天然高分子材料包埋固定化磷脂酶。天然高分子材料无毒无害，传质性好，但机械强度低，易溶解，容易受金属离子的影响。于殿宇等[14]以纤维素为载体，得到结合牢固，稳定性好的共价固定化磷脂酶。

磁性Fe3O4纳米离子具有较大的比表面积，同时具有的超顺磁性，即在外加磁场中具有磁性，当外加磁场消失时其磁性也会消失，因此可以很方便的将固定化酶从反应体系中回收重复利用[15]。虽然磁性Fe3O4纳米粒子具有纯度高，磁性稳定，比表面积大等优点，但作为金属粒子，在溶液中易与氢离子结合使其表面带有较强的正电荷，相比其他有机材料更容易团聚，因此对Fe3O4纳米粒子表面进行改性，成为制备固定化载体重要的一步[16]。用有机试剂对磁性纳米粒子进行改性，不仅可以使其表面拥有特定的活性基团，同时还保留了无机磁性材料的磁响应优点。杨兆壬[17]、谈昭君[18]等通过高锰酸钾氧化得到表面羧基化的磁性Fe3O4载体。李晔[19]、阮贵华[20]等以γ-氨丙基三乙氧基硅烷改性得到氨基化的磁性Fe3O4载体。Fe3O4作为无毒无害的环保材料，在食品加工处理领域具有重要的意义[21-22]。使用Fe3O4磁性纳米粒子作为载体进行固定化反应，能实现固定化酶与反应体系的高效分离，提高酶的重复使用率，降低生产成本，有利于实现连续化生产[23]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lecitase® Ultra磷脂酶A1（酶活力5 000 U/mL）丹麦诺维信公司；大豆卵磷脂 上海蓝季科技发展有限公司；Fe3O4纳米粒子、硅酸乙酯（ethyl silicate，TEOS）、戊二醛（50%） 阿拉丁试剂有限公司；乙醇、氨水、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、95%乙醇溶液 展望化工试剂有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，3-APTES） 上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HitachiS-4800场发射扫描电子显微镜 日本日立公司；Tecnai G2-T20场发射透射电子显微镜 美国FEI公司；Nicolet-8700傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器公司；MiniFlex-600 X射线衍射仪 日本株式会社理学公司。

1.3 方法

1.3.1 载体的制备

Fe3O4-SiO2磁性复合载体的制备：取2 g Fe3O4纳米粒子，加入到含有160 mL乙醇、40 mL水、5 mL氨水的混合液中，超声处理1 h后，然后将5 mL TEOS缓慢加入到该溶液体系，室温、350 r/min连续机械搅拌反应12 h。用去离子水将沉淀洗涤数次，然后用0.1 mol/L盐酸处理沉淀12 h，以去除未包裹上SiO2的Fe3O4纳米粒子，将沉淀物在室温下真空干燥24 h。

3-APTES改性的Fe3O4-SiO2磁性复合载体的制备：在250 mL圆底烧瓶中，加入1 g磁性Fe3O4-SiO2载体，超声处理1 h，使载体均匀分布在60 mL乙醇中。然后加入6.0 mL NH3·H2O，继续超声10 min，随后向反应液中缓慢加入4.0 mL 3-APTES，在50 ℃持续搅拌反应8 h。反应用永久性磁铁将载体和溶液分离，并分别用乙醇和水充分洗涤至中性。最后，将3-APTES改性的Fe3O4纳米颗粒在常温下真空干燥24 h，获得含有氨基官能团的Fe3O4-SiO2磁性复合载体[24-25]。

Fe3O4-SiO2磁性复合载体的交联：在50 mL锥形瓶中加入2 g改性后的复合载体，加入一定质量分数戊二醛（使用pH 7.0，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释）进行交联，室温下，放置在摇床上以转速150 r/min，反应12 h。反应完成后，用去离子水将载体反复洗涤，得到交联复合载体[26-27]。

1.3.2 磷脂酶的固定化

称取交联后的Fe3O4-SiO2复合载体50 mg放入锥形瓶中，加入预定量0.02 g/mL磷脂酶A1液（一定pH值的磷酸缓冲液稀释）。在水浴摇床中，于设定的温度、150 r/min反应预定的时间。随后把固定化好的磷脂酶A1用永久性磁铁分离，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）反复洗涤直到上清液中检测不到游离酶为止，固定化磷脂酶置于4 ℃冰箱中保存备用[28-29]。

1.3.3 固定化磷脂酶活力的测定

参照文献[30]方法。将15.0 mL底物溶液于100.0 mL锥形瓶中，将锥形瓶放置50 ℃气浴摇床上，预热8.0 min。加入固定化磷脂酶，在160 r/min、50 ℃条件振荡下反应10.0 min后，立刻加入10.0 mL的95%乙醇溶液终止反应。用0.1 mol/L NaOH标准液，采用自动电位滴定仪滴定反应后的溶液，通过实验组和空白组计算NaOH标准液消耗量，测得固定化磷脂酶活力。酶活力回收率和蛋白固载率的计算见公式（1）和（2）：

式中：A1为固定化酶总活力/（U/mL）；A2为原酶液总活力/（U/mL）。

式中：C1为加入载体中蛋白含量/（mL/mg）；C2为残液中蛋白含量/（mL/mg）。

1.3.4 固定化载体的表征

场发射扫描电子显微镜采用电子枪为冷场发射电子源，加速电压20 kV，分辨率1.4 nm，放大倍数30～80万倍；透射电子显微镜采用的电子枪为LaB6，加速电压200 kV，线分辨率0.144 nm，点分辨率0.248 nm，放大倍数25～110万 倍；傅里叶红外光谱仪扫描区间为4 000～400 cm－1；X射线衍射仪采用的X射线源为Cu靶Kα射线，石墨单色器，管压力15 kV，管电流30 mA，扫描速率5 °/min，扫描范围2θ为20°～70°。对样品的形态结构、粒径大小、化学组分进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 磷脂酶A1固定化单因素试验结果

2.1.1 pH值对固定化的影响

在温度4 0 ℃、戊二醛质量分数4%、加酶量4 mL/50 mg、固定化时间6 h条件下，考察pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）对磷脂酶A1固定化的影响，结果如图1所示。

图1 pH值对磷脂酶A1固定化的影响Fig. 1 Effect of pH on the immobilization of phospholipase A1

由图1可知，随着固定化pH值的增加，固定化磷脂酶A1的酶活力回收率和蛋白固载率均先增大后减小。在pH 6.0时回收率和固载率都达到最大，当pH值继续增加时，回收率和固载率持续降低。其原因是pH值改变能影响酶的活性部位和载体上相关官能团的解离，在一定的解离程度下，适合酶和载体发生固定反应。另一方面，磷脂酶的化学本质是蛋白质，当pH值过低或过高时，蛋白质的次级键和空间结构被破坏，从而使酶的生物活性丧失，酶活力降低。

2.1.2 固定化温度对固定化的影响

在固定化pH 6.0、戊二醛质量分数4%、加酶量4 mL/50 mg、固定化时间6 h的条件下，考察固定化温度（25、30、35、40、45 ℃）对磷脂酶A1固定化的影响，结果如图2所示。

图2 固定化温度对磷脂酶A1固定化的影响Fig. 2 Effect of temperature on the immobilization of phospholipase A1

由图2可知，随着固定化温度的升高，酶活力回收率增大，当温度达到30 ℃时，酶活力回收率达到最高，随着固定化温度的继续升高，酶活力回收率反而下降。原因是温度升高使酶分子活化，碰撞次数增加，酶与载体接触机会上升，从而有利于固定化反应，当温度过高时，使酶分子的构象发生变化，影响酶活力。温度对固载率影响不大，在35 ℃时固载率达到最大。综合考虑酶活力回收率和蛋白固载率，最后选择最适固定化温度为30 ℃。

2.1.3 固定化时间对固定化的影响

在固定化pH 6.0、固定化温度30 ℃、戊二醛质量分数4%、加酶量4 mL/50 mg的条件下，考察固定化时间（4、8、12、16、20 h）对磷脂酶A1固定化的影响，结果如图3所示。

图3 固定化时间对磷脂酶A1固定化的影响Fig. 3 Effect of time on the immobilization of phospholipase A1

由图3可知，酶活力回收率在初始阶段随着时间的延长而提高，在8 h时达到最高，继续延长固定化时间，酶活力回收率基本保持不变。原因是在初始阶段随着时间的延长，酶分子不断固定到载体上，当载体上活性基团连接的酶分子达到饱和后，继续延长时间，酶分子与载体也不会发生有效的固定化反应，酶活力回收率和蛋白固载率基本保持不变。

2.1.4 戊二醛质量分数对固定化的影响

在固定化pH 6.0、固定化温度30 ℃、固定化时间8 h、加酶量4 mL/50 mg的条件下，考察戊二醛质量分数（2%、4%、6%、8%、10%）对磷脂酶A1固定化的影响，结果如图4所示。

图4 戊二醛质量分数对磷脂酶A1固定化的影响Fig. 4 Effect of glutaraldehyde concentration on the immobilization of phospholipase A1

戊二醛作为常用的交联剂，本身所具有的醛基能与载体上游离的氨基反应生成亚胺基团（－RC=N－），使载体与载体连接起来，从而增大酶与载体的接触面积，有利于酶的固定化反应。由图4可知，酶活力回收率随戊二醛质量分数的增加，先升高后降低。在戊二醛质量分数小于8%时，磁性载体表面的醛基随着戊二醛的质量分数增大而变多。当戊二醛质量分数高于8%时，载体表面过度醛基化，使酶与载体交联过度，空间位阻变大，酶活力位点受限。戊二醛质量分数对蛋白固载率影响较大，随着戊二醛质量分数增加，载体提供的结合位点增多，与磷脂酶结合的机率增大，更利于酶的固定化，但戊二醛质量分数过高也会使酶丧失部分活力。

2.1.5 加酶量对固定化的影响

在固定化pH 6.0、固定化温度30 ℃、固定化时间8 h、戊二醛质量分数8%的条件下，考察加酶量（2、4、6、8、10 mL/50 mg）对磷脂酶A1固定化的影响，结果如图5所示。

图5 加酶量对磷脂酶A1固定化的影响Fig. 5 Effect of enzyme amount on the immobilization of phospholipase A1

由图5可知，在加酶量较低时，酶活力回收率随着加酶量的增加而提高，当加酶量达到8 mL/50 mg载体后，继续加大酶量，固定化酶的酶活力回收率反而会下降。这是由于一定量的载体可以固定的酶量是一定的，当载体固定化位点达到饱和，再继续添加酶反而会使酶分子聚集成团，使酶分子之间的活性位点彼此覆盖，空间位阻增大，对酶活力产生抑制作用。在加酶量达到8 mL/50 mg后蛋白固定率持续降低，使酶的利用率下降。在考虑最适加酶量时应考虑蛋白固载率，避免造成不必要的浪费，而且降低成本对酶的固定化经济效益有利。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果，设计响应面试验，确定最佳固定化条件，每组试验重复3 次，因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Variables and their levels used for response surface design

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

响应面试验设计与结果见表2所示，方差分析结果见表3所示。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation

通过Design-Expert 8.0.6分析，可以得到固定化条件与酶活力回收率之间的二次多项式模型为Y=61.34+5.52A+3.83B+6.14C+2.28D－2.02AB－3.50AC+3.91AD－6.08BC－3.64BD－4.06A2－6.21B2－5.53C2－8.97D2。根据二次多项式，可确定固定化磷脂酶A1的最佳固定化pH 6.67、固定化时间7.92 h、戊二醛质量分数8.34%、加酶量8.24 mL/50 mg[31]。

由表3回归模型的方差分析可知，R2=0.966 3，说明该模型能较好地反映固定化磷脂酶A1的酶活力回收率随固定化条件的变化规律，模型的P值小于0.000 1，说明此模型极显著，失拟项P值为0.238 5大于0.05，说明模型拟合良好，可以接受。校正决定系数j=0.937 4，表明此方程能够解释响应值93.74%的变化。AC、AD、BC、BD交互作用对固定化磷脂酶A1的酶活力回收率影响较为显著，且主次顺序为BC＞AD＞BD＞AC[32-33]，两因素交互作用的响应面3D图和等高线图见图6。

图6 各因素交互作用对酶活力回收率影响的响应面和等高线Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four variables on the recovery of enzymatic activity

2.2.2 验证实验结果

根据响应面法获得的最佳固定化条件，进行3 次平行验证实验，根据实验的可操作性，最终确定的条件为固定化pH 6.7、固定化时间7.9 h、戊二醛质量分数8.3%、加酶量8.2 mL/50 mg。在此条件下固定化加酶量2 mL/50 mg的酶活力回收率为63.6%，蛋白固载率为68%， 落在响应值Y的95%预测区间[56.17%，66.50%]内，说明所建立的回归模型具有较好的拟合性。

2.3 磁性固定化磷脂酶A1的表征分析

2.3.1 扫描电子显微镜分析

图7 样品扫描电子显微镜图Fig. 7 Scanning electron microscope images of samples

由图7可知，Fe3O4磁性纳米粒子基本形貌为球状，具有良好的分散性，团聚较少，其平均粒径在15 nm左右。Fe3O4-SiO2磁性复合载体的粒径较为均一，表面平滑，呈球状，各载体间分散性良好，载体的平均粒径为200 nm左右，比表面积大。复合载体平均粒径大于Fe3O4纳米颗粒，表明SiO2成功地包裹在Fe3O4粒子表面，包裹后的Fe3O4-SiO2复合载体表面含有大量的羟基，可通过改性在其表面添加活性基团。磁性固定化磷脂酶A1之间交联效果良好，同样具有较好的分散性，有利于固定化酶与底物接触反应[34]。

2.3.2 透射电子显微镜分析

图8 样品的透射电子显微镜图Fig. 8 Transmission electron microscope image of samples

从图8可知，Fe3O4纳米颗粒的分散性较好，极少团聚，有利于TEOS均匀地包裹在磁性纳米材料表面。磁性固定化磷脂酶A1与Fe3O4纳米粒子形态相似，各固定化载体之间均匀分散，呈核壳形，中间黑色的实心为Fe3O4纳米颗粒，载体周围呈现出均匀的灰色薄层，可看出SiO2均匀地包裹在Fe3O4纳米颗粒表面[35-36]。

2.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

图9 样品的傅里叶变换红外光谱图Fig. 9 Fourier transform infrared spectraof samples

在图9b、c中，1 092 cm－1处较强的吸收峰是Si—O—Si键的伸缩振动吸收峰，表明SiO2成功地包裹在载体表面，1 544 cm－1处较弱的峰是酰胺特征吸收峰，说明磷脂酶成功地固定到磁性载体上。1 631 cm－1处较强的吸收峰表明水分子物理吸附到载体表面，3 421 cm－1处是—OH的伸缩振动峰。

2.3.4 X射线衍射分析

在图10a、b、c中均能观察到独立的窄的尖锐衍射峰，说明各样品纯度高，为较好的“晶态”物质。与X射线衍射标准卡片（PDF 19-0629）对照得出，衍射图谱上的2θ为30.15°、35.47°、43.10°、53.44°、56.99°、62.51°的衍射角分别很好地对应材料中反尖晶石型晶体结构磁性Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）晶面。固定化PLA1的特征衍射峰明显弱于Fe3O4磁性纳米粒子，是因为固定化PLA1中的Fe3O4相对含量较低[37-38]。

2.4 固定化磷脂酶的酶学特性分析

2.4.1 最适温度和pH值

图11 游离酶和固定化酶的最适温度和pH值Fig. 11 Optimal temperature and pH for the free and immobilized enzyme

在不同温度下测定游离酶和固定化酶的酶活力，以酶活力最大的组为100%，其余各组的酶活力与最大酶活力的比值即为相对酶活力。由图11可知，游离酶和固定化酶的最适反应温度均为50 ℃，但固定化酶受温度的影响比游离酶小，在更广的温度范围内可以保持相对较高的酶活力。可能是因为固定化反应使酶的空间结构发生改变，使其对温度的耐受程度得到提高。游离酶的最适反应pH 5.0，固定化酶的最适反应pH 6.0。相比游离酶固定化酶的最适pH值变大，pH值稳定性更好。可能是固定化使酶的带电性质改变，或者是固定化载体材料使酶的微观环境发生变化。

2.4.2 操作稳定性

图12 固定化酶的操作稳定性Fig. 12 Reusability of the immobilized enzyme

固定化酶在50 ℃与底物反应10 min，经过10 次反应后，固定化酶保留61%的初始酶活力。由图12可知，在前4 次反应中固定化酶活力损失严重，可能是由于与载体结合不牢固的那一部分磷脂酶，在反应过程中从载体上脱落，造成酶活力降低幅度较大。

图13 固定化酶和游离酶的贮藏稳定性Fig. 13 Storage stability of the immobilized and free enzyme

将固定化酶和游离酶贮藏在4 ℃冰箱，每隔5 d定时测酶活力，如图13所示。固定化酶和游离酶相对酶活力随贮藏时间的延长，在25 d后，固定化酶相对酶活力保持在83%以上，游离酶在79%左右，相对于游离酶，固定化酶的稳定性得到了改善。

3 结 论

通过响应面试验，确定Fe3O4纳米粒子固定化磷脂酶A1的最优条件：固定化pH 6.7、固定化温度30 ℃、固定化时间7.9 h、戊二醛质量分数8.3%、加酶量8.2 mL/50 mg，在此最佳条件下制得磁性固定化磷脂酶A1的酶活力回收率能达到63.6%，蛋白固载率为68%。

通过表征分析表明磷脂酶被成功固定到了载体表面。固定化载体分散均匀，粒径均一，平均粒径在200 nm左右。固定化酶的最适反应温度50 ℃，最适pH 6.0，热稳定性、pH值稳定性和贮藏稳定性均高于游离酶，重复使用固定化酶10 次后，仍保留61%的初始酶活力。

磷脂酶A1具有宽泛的底物专一性，且反应彻底速率快，常被应用于食物油的脱胶处理。本实验使用价格低廉且无毒害作用的Fe3O4纳米粒子作为固定化载体，符合当下倡导的生态文明理念。固定化酶的热稳定性好，能与产物迅速分离，便于回收重复利用。与其他改性方法相比，使用3-APTES和戊二醛改性得到的载体，表面具有大量的活性基团，能在较为温和的条件下与酶更好的接触发生化学反应，所制得的固定化磷脂酶A1不仅酶活力高，而且稳定性好，为食用油酶法脱胶领域的研究和发展提供参考。