赵建华，李浩霞，尹 跃，王亚军，李彦龙，樊云芳，安 巍，曹有龙

（1.宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，国家枸杞工程技术研究中心，宁夏 银川 750002；2.宁夏农林科学院荒漠化治理研究所，宁夏 银川 750002）

木糖异构酶（EC 5.3.1.5）在生物体内的糖代谢过程中发挥着重要的作用[1-2]，主要参与醛糖对酮糖的转化，尤其是木糖对木糖的转化；也参与D-葡萄糖转化为D-果糖的异构化反应。木糖异构酶与蛋白酶、淀粉酶等同为重要的工业用酶，具有极其重要的价值[3-5]。在细菌和一些厌氧型真菌中，木糖异构酶能直接将木糖转化为木酮糖，不产生副产物，有利于乙醇的生产[6-8]。近年来，随着生物能源产业的发展，利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖生产乙醇的重组菌成为研究热点[9-10]。研究发现，拟南芥的木糖异构酶能够在酿酒酵母中表达活性，且活性可达到0.51 U/mg[4]，提高了酿酒酵母利用木糖发酵生产乙醇的能力；Kristo等[11]成功克隆出大麦的木糖异构酶全基因序列4 473 个核苷酸，含有20 个内含子，编码的蛋白为二聚体。此外，木糖异构酶基因xylA还作为一种正向选择标记基因，该标记可以获得安全的转基因植物[12]。Haldrup等[13]研究以D-木糖为唯一碳源培养基筛选转化的马铃薯、烟草和西红柿等植物细胞，成功获得了转基因植株；郭新梅等[14]利用木糖异构酶为筛选标记，发现转基因玉米的再生植株在木糖质量分数为50%～100%时，筛选效果较好，但不同基因型的玉米对应的最佳筛选浓度存在差异。迄今为止，已在细菌、真菌和放线菌等多种微生物中以及植物中鉴定出木糖异构酶[15-16]，在Swiss-Prot/TrEMBL数据库中已经公布了来源于近百种微生物木糖异构酶的氨基酸序列[17-18]。

目前，从植物中分离出xylA较少，顿宝庆等[4]分离出拟南芥的xylA，为改善酵母利用木糖提供了新的可用的木糖异构酶。枸杞果实含有丰富糖类物质，主要糖为果糖、葡萄和蔗糖[19]，成熟果也含有一定量木糖[20-21]。有关枸杞木糖异构酶基因（Lycium barbarum Linn. xylose isomerase，LbxylA）的克隆表达研究尚鲜见报道。本研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料，基于枸杞果实转录组测序数据，从枸杞果实中克隆LbxylA的cDNA全长，诱导重组质粒pGEX4T-1-LbxylA在大肠杆菌中表达，并对得到LbxylA融合蛋白进行多克隆抗体制备，有助阐明该基因在果实糖积累过程中作用机理，为进一步改善枸杞果实品质及转基因植株标记选取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试枸杞品种为‘宁杞1号’（15 a生），采自国家枸杞种质资源圃（38°380′N，106°9′E，海拔1 100 m），于‘宁杞1号’幼果期（开花后约9 d）、青果期（开花后约15 d）、色变期（开花后约22 d）、初熟期（开花后约29 d）和成熟期（开花后约36 d）分别采样，选取果粒大小均匀、果色一致的无病虫害果实，用液氮迅速冻结后，运送回实验室后立即放置于－80 ℃冰箱保存备用。

DH5α、Rosetta（DE3）、pGEX4T-1均由本实验室保存；Trizol试剂盒、质粒小量提取试剂盒、NI Crystarose FF天根生化科技（北京）有限公司；逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒 美国Thermo Fisher公司；KOD FX Neo酶 日本Toyobo公司；pMD18-T、限制性内切酶 德国TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix美国Bio-Rad公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚兰、考马斯亮兰R-250、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、过硫酸铵德国Amresco公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔IgG和四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）显色液、BeyoECL Star kit显色试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GL-20C高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；ProFlex系列PCR仪 美国ABI公司；CFX Connect™荧光定量PCR检测系统、ChemiDoc™XRS+凝胶成像系统、iMARK酶标仪 美国Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪北京市六一仪器厂；SM-650A超声波细胞破碎仪 南京舜玛仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1LbxylA全长的克隆

采用Trizol试剂盒提取枸杞果实的总RNA，用RT-PCR试剂盒对提取的总RNA进行反转录，获得单链cDNA。基于转录组测序数据，获得unigene编号为TR29089|c0_g1的表达序列标签（expressed sequence tags，EST）序列（数据未发表），利用Primer Premier 5.0软件设计全长引物LbxylA-F和LbxylA-R（表1）。反应体系为：2×PCR Buffer 25 μL，dNTP（2 mmol/L）10 μL，LbxylA-F（10 μmol/L）2 μL，LbxylA-R（ 1 0 μ m o l/L ） 2 μ L， 单 链 c D N A 1 μ L ，KOD FXNeo1 μL，Millipore H2O补足50 μL。反应程序为：98 ℃预变性5 min；循环为98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30 个循环；68 ℃延伸5 min。PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上进行测序。

1.3.2 实时荧光定量表达分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

根据LbxylA基因序列设计荧光定量引物LbxylA-qRTF和LbxylA-qRTR（表1）。18S基因作为内参基因。在荧光定量PCR仪中进行扩增，反应体系为：SYBR Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板5 μL，Millipore H2O补足25 μL。反应条件为：95.0 ℃预变性3 min；循环为95.0 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，75 ℃读板5 s，共40 个循环；溶解曲线从65 ℃上升到95 ℃，每次读板上升0.5℃。LbxylA在不同发育期果实中的相对表达量采用比较阈值法测定。通过计算2－ΔΔCt值确定该基因的相对表达量。

1.3.3 生物信息学分析

用DNAman软件推导出LbxylA相应氨基酸序列。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）完成蛋白基本性质分析。采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）完成亚细胞定位分析。使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对序列的结构域和功能进行分析。在NCBI网站运行的BLASTP程序数据库中对LbxylA氨基酸序列进行相似性搜索。利用MEGA 7软件中提供的比对功能进行多序列比对并基于邻接法构建系统进化树。

1.3.4 原核表达载体构建与鉴定

利用分别带有BamHI和SalI酶切位点的xylA-F和xylA-R引物对LbxylA基因开放阅读框（open reading frame，ORF）全长进行PCR扩增，所获PCR产物进行酶切、纯化，连接到pGEX4T-1载体相同酶切位点，连接体系（10 μL）为10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、目的基因3 μL、pGEX4T-1 1 μL、T4 DNA Ligase（5 U/μL）1 μL、ddH2O 4 μL，16 ℃连接2 h，置于4 ℃冰箱过夜保存。将过夜连接产物直接转化感受态细胞DH5α，挑选单克隆进行酶切验证后，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

通识模块包括英语、计算机、形势与政策、毛泽东思想和中国特色社会主义理论体系等。这一模块使学生初步确立将来为第一线服务的意识，掌握实验基本技能和方法。

1.3.5 重组质粒的诱导纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

将测序正确的重组质粒pGEX4T-1-LbxylA转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定。阳性克隆接种于4 mL LB培养基中37 ℃培养过夜。按照1%接菌量将过夜培养液接种于400 mL LB培养基中，28 ℃、220 r/min振荡培养5 h，加入0.5 mmol/L IPTG，18 ℃、220 r/min继续振荡诱导10 h，离心收集菌体。未加入IPTG诱导的pGEX4T-1-LbxylA作为阴性对照。另取菌液按照每克湿质量菌体/2～5 mL平衡缓冲液的比例，充分悬浮起收集的菌体，超声波破碎菌体，20 000 r/min离心15 min，收集上清液，或用0.45 μm滤膜过滤。使用10 倍介质体积缓冲液A（平衡缓冲液：10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，调节pH值至7.4）过柱，平衡介质（介质为Ni琼脂糖凝胶），上样；用5～10 倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；用5～10 倍介质体积缓冲液B（洗脱缓冲液：300 mmol/L咪唑，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，调节pH值至7.4）洗脱，收集洗脱液；用5～10 倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。

1.3.6 多克隆抗体制备

取纯化的LbxylA融合蛋白，用Bradford法测定蛋白含量，并配成2 mg/mL的溶液。将上述溶液与等量完全弗氏佐剂乳化，注射于大白兔皮下进行初次免疫，每只注射0.5 mg；14 d后的加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化，加强免疫于肌肉注射，剂量为每只注射0.3 mg，每14 d加强免疫1 次。第60天后从耳缘静脉采血，每只兔子采集1 mL，采用间接酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法测定抗血清的效价。以纯化的GST-LbxylA融合蛋白包被ELISA板，覆膜，置于4 ℃过夜，TBST（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1% Tween-20，pH 7.5）洗涤3 次，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入不同稀释比例的抗血清及免疫前的血清作对照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗涤3 次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。洗涤3 次，加TMB底物显色10 min，各反应孔中加入2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪检测450 nm波长处吸光度，免疫后的血清A450nm/免疫前的血清A450nm大于2.1，判断为阳性。抗血清效价超过1∶3 200，可用于抗体纯化和后期检测。将免疫好的白兔禁食24 h，颈部动脉取血，5 000 r/min离心15 min获得抗血清，采用ProteinA亲和层析法，对抗血清进行纯化。以上多克隆抗血清由武汉转导生物实验室（Bio-transduction Lab，动物使用许可证编号为SYXK（鄂）2012-0065）完成。

1.3.7 Western blot检测

新鲜植物组织，液氮研磨后，按照0.22 g/mL比例加入预冷的蛋白提取缓冲液，4 ℃裂解2 h。12 000 r/min离心20 min，收集上清液。取一份样本，按照BCA法进行蛋白含量检测。按照蛋白含量检测结果，将另一份样品进行稀释，调成相同蛋白浓度。加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃沸水浴5 min。12% SDS-PAGE分离总蛋白条带。将SDS-PAGE条带转移至0.22 μm PVDF膜。以5 g/L脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，抗重组LbxylA融合蛋白兔血清（1∶400）4 ℃过夜，TBST洗3 次，每次5 min。山羊抗兔IgG HRP（1∶1 000）37 ℃孵育45 min，TBST洗6 次，每次5 min。加入超敏发光液，在凝胶成像系统成像，对条带进行分析。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010和DPS 8.05统计软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 LbxylA克隆分析

图1 1 LbxylAbxylA的PCR扩增检测结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified LbxylA

图2 2 LbxylAbxylA测序结果及预测氨基酸序列分析Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LbxylA

2.2 LbxylA所编码氨基酸序列及进化树分析

将LbxylA所编码氨基酸序列进行BLASTP分析，该序列与其他植物xylA基因编码的氨基酸序列有较高一致性，该基因命名为LbxylA，NCBI注册号为KX775441。

进一步使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对其结构域进行分析，发现该基因Asn17～Leu481位氨基酸序列与木糖异构酶结构域（PLN02923）有较高相似性，其E-value为0×100。该蛋白具有木糖异构酶显著特征，同时在序列中发现了可能的酶活性位点（His147）以及7 个金属离子结合位点（图2），分别为Glu277、Glu313、His316、Asp341、Asp352，跨膜区域疏水区锚定到ER膜（其可信度系数为5.5）。利用Uniprot数据库BLASTP比对发现，LbxylA氨基酸序列与马铃薯和烟草xylA氨基酸序列相似性较高，序列同源性达到95%。利用MEGA 7软件构建包括LbxylA及数据库中获得的xylA氨基酸序列的系统发育树。结果（图3）表明，枸杞的LbxylA与茄科物种，如烟草、辣椒、马铃薯聚类到一个分支，这与该物种间具有较高的同源性相一致。

图3 枸杞与其他植物xylA蛋白系统进化树分析Fig. 3 Phylogenetic tree of xylA proteins in L. barbarum Linn. and other plants

2.3 重组质粒pGEX4T-1-LbxylA的构建与鉴定

利用分别带BamHI和SalI酶切位点的引物对LbxylA基因ORF全长进行扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，与目的片段1 443 bp大小一致（图4A）。将PCR产物酶切纯化后，连接至pGEX4T-1载体多克隆位点，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR（图4B）和双酶切验证（图4C），均能检测到目的条带，且测序结果正确，表明重组质粒pGEX4T-1-LbxylA构建成功。

图4 4 LbxylAbxylA的PCR及重组质粒pGEX4T-1-4T-1-LbxylAbxylA的鉴定Fig. 4 PCR amplification of LbxylA and identification of recombinant plasmid pGEX4T-1-LbxylA

2.4 枸杞融合蛋白在大肠杆菌中的表达及抗体制备

挑取重组质粒转化Rosetta（DE3）的阳性菌落，过夜培养，转接到新鲜的培养基后，当OD600nm为1.0时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃诱导4 h，利用SDS-PAGE检测，结果见图5A，重组质粒pGEX4T-1-LbxylA得以表达，且在77 kDa左右的位置有特征蛋白条带出现，与理论大小76.2 kDa基本相符，说明融合蛋白中LbxylA蛋白得到表达。进一步发现1号克隆和3号克隆的表达水平相对较高，随后选取1号克隆进行下一步研究。为检测LbxylA蛋白在大肠杆菌中重组表达时的可溶性，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG，18 ℃诱导表达10 h。结果表明（图5B）LbxylA部分可溶，在上清液和沉淀中均能检测到LbxylA蛋白的表达。分别纯化了可溶蛋白和包涵体蛋白（图5C），可溶蛋白用于后期血清的检测实验，包涵体蛋白用于兔多克隆抗血清制备。

图5 重组大肠杆菌pGEX4T-1-LbxylA的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed and purified LbxylA protein

将纯化后可溶蛋白作为检测对象，通过间接ELISA法检测抗血清效价，结果表明，获得的抗血清效价高于1∶243 000，为高品质抗血清。进一步使用Protein A纯化血清中的IgG，结果为纯化后抗体效价高于1∶81 000，同时，Western blot检测结果表明，说明获得的LbxylA抗体与抗原之间有特异性条带（图6），可以用于后续研究。

图6 LbxylA抗体有效性的Western blot检测Fig. 6 Western blot of antibody against recombinant LbxylA

2.5 枸杞果实中LbxylA表达分析

以不同发育期的枸杞果实为试材，利用实时定量RT-PCR的方法检测LbxylA基因的相对表达量，利用Western blot法检测LbxylA所编码蛋白的变化，结果如图7所示，随着果实发育进程LbxylA相对表达量整体呈现出下降的趋势，其中，在果实发育前期（开花后约0～15 d）果实中LbxylA表达量急剧下降，但在果实发育中后期（开花后约22～36 d）果实中的LbxylA表达量维持着恒定水平。LbxylA蛋白表达水平与LbxylA表达量的变化趋势基本一致，但在果实发育前期（开花后约0～15 d）LbxylA蛋白表达水平略有升高趋势，随后逐渐降低，在果实发育中后期同样维持着恒定水平，这就表明在果实发育前期由于基因翻译及翻译后加工可能导致蛋白表达滞后。

图7 7 LbxylAbxylA基因在不同果实发育阶段的表达模式Fig. 7 Expression pattern of LbxylA at different fruit development stages of L. barbarum

3 讨 论

近年来，随着植物基因工程的发展以及模式基因组进展加快，对xylA的功能及结构特征有了较为深入的研究。Madhavan等[22]从真菌中分离出全长序列为1 314 bp的xylA，编码有437 个氨基酸，蛋白质分子质量为49 kDa；Kim等[23]从嗜热菌中分离出xylA基因，该基因编码438 个氨基酸，蛋白质分子质量为50.17 kDa。本研究从枸杞中分离出LbxylA，该基因序列全长为1 446 bp，其中，ORF为1 446 bp，编码有481 个氨基酸，蛋白质分子质量为53.54 kDa，理论等电点5.37。本研究中采用生物信息学方法，分析发现LbxylA基因编码的氨基酸序列存在7 个金属离子结合位点，其位点与金属离子结合有利于维持蛋白质空间结构稳定性[24]，此外，许伟等[25]发现木糖异构酶单亚基活动中心，存在两个二价金属离子结合位点，参与底物结合和催化过程，并维持活动中心残基功能。进一步分析发现LbxylA基因序列与烟草和马铃薯的xylA序列相似性较高，达到95%，这表明LbxylA与同科植物xylA基因同源性较高，基因结构功能也较为相近，从而可以推测该基因存在相对独立的进化过程。

研究发现，在细胞体内木糖异构酶将木糖异构化为木酮糖，被应用在木质纤维素微生物发酵生产乙醇[3]；另外，在体外木糖异构酶可将葡萄糖催化为果糖的异构化反应，这被大规模应用于高果糖浆的工业生产[26]。将细菌的xylA基因导入到马铃薯块茎后，马铃薯块茎中己糖组成发生改变，从而对马铃薯的新陈代谢产生一定的影响[27]。在本研究中，在果实的发育前期，果实中LbxylA的蛋白水平滞后于该基因相对表达量，但在果实发育中后期两者变化相一致，这表明枸杞果实发育的不同阶段LbxylA由于基因翻译及翻译后加工，使该基因存在时空间的差异，此外，LbxylA变化是否还与果实中糖含量高低有关，有待于进一步研究。