白 英，刘乃齐

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是一种具有高分子质量的聚合物，由发酵乳制品中一定的乳酸菌（如链球菌、乳酸杆菌、乳球菌和明串珠菌）原位代谢产生，其溶于水后形成一种胶体，可增加发酵乳的黏度[1]。能够改善产品的流变性和加工特性。因此，产EPS的乳酸菌被广泛用于乳制品工业中。肠球菌（Enterococcus spp.），包括粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium），作为乳酸菌家族中的一员，是人体及动物肠道中的正常菌群[2]。Bhat等[3]研究发现，分离自E. faecium K1的多糖具有明显的生物活性。另有研究表明，菌株E. faecium MC13所产多糖具有良好的乳化及絮凝活性[4]。产EPS菌株E. faecium RI 41、RI 56、RT 81均有良好的自聚集和与Escherichia coli ATCC 11230的共聚集能力[5]。

本研究中菌株E. faecium AS8所产EPS分别通过Sephadex G-100和Sephadex G-50进行分离纯化；通过流变仪对不同发酵乳进行流变学分析，分别研究纯化EPS及菌株E. faecium AS8对发酵乳流变学特性的影响；采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法对单糖组成进行测定；傅里叶变换红外光谱仪进行多糖结构分析。实验从EPS结构方面分析发酵乳凝胶的形成、流变学特性，为以后发酵乳生产优化提供参考，以乳酸菌本身含有的成分改善发酵乳的特性，具有良好的安全性，在一定程度上减少了制作发酵乳过程中添加剂的使用，具有很好的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

E. faecium AS8[6]分离自内蒙古自治区锡林郭勒盟地区的传统发酵奶油制品；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus） 内蒙古双奇药业股份有限公司；脱脂乳粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

Sephadex G-100 美国Pharmacia公司、Sephadex G-50 北京Coolaber公司；Solarbio透析袋（8 000～10 000 Da） 内蒙古仁玖商贸有限公司。

脱脂乳培养基：脱脂乳粉10 g，加入100 mL的蒸馏水，加热搅拌均匀，调节pH值至6.8，110 ℃灭菌15 min后迅速冷却；MRS液体培养基：蛋白胨1 g、磷酸氢二钾0.2 g、酵母浸膏0.5 g、牛肉膏1 g、乙酸钠（3H2O）0.5 g、柠檬酸氢二铵0.2 g、硫酸镁1 g、硫酸锰0.2 g、吐温-80 0.1 mL、葡萄糖2 g，加蒸馏水100 mL，搅拌加热溶解后调pH值至6.8，121 ℃灭菌20 min。

牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂） 广东环凯微生物科技有限公司；吐温-80、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰（均为化学纯） 天津市大茂化学试剂厂；苯酚、浓硫酸、95%乙醇、无水葡萄糖、盐酸、氯仿、双氧水、正丁醇、标准蛋白质、考马斯亮蓝-G250（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；标准单糖（鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SX-500全自动高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY公司；T6-新世纪紫外-可见分光光度仪 北京普析通用仪器有限责任公司；HC-2T18R型冷冻高速离心机 日本Hitachi公司；BX50型光学显微镜 日本Olympos公司；SW-CJ-1D型超净台 苏州安泰空气技术公司；303-OA型生化培养箱 天津市通利信达仪器厂；DW-86L338A型冻干机（－80 ℃） 青岛海尔特种电器有限公司；YC-2型层析实验冷柜 上海谷宁仪器有限公司；Haake RS6000旋转流变仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

将乳酸菌AS8接种到灭菌后的脱脂乳培养基中，37 ℃培养24 h。将其转接到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h。将3%（V/V）MRS培养物（108CFU/mL）接种到含有300 mL MRS培养基的500 mL锥形瓶中，在30 ℃培养24 h，用于后续实验。

1.3.2 EPS产量的测定

取活化后菌液10 mL，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入4 倍体积的95%乙醇溶液（4 ℃预冻），在4 ℃的条件下过夜，然后将混合液10 000 r/min离心10 min，收集沉淀，用约10 mL蒸馏水进行溶解，以蒸馏水作为透析液对溶解液进行透析，共透析12 h（隔2 h换一次透析液）。用苯酚-硫酸法对透析液吸光度进行测定，最后根据EPS的标准曲线计算其产量。0～32 h内每隔4 h用苯酚-硫酸法测定EPS产量的变化情况并绘制曲线。

1.3.3 EPS粗提

将实验菌株在37 ℃、24 h的条件下培养3 代后，将培养液9 000 r/min离心8 min，收集上清液，加入4 倍体积的95%冷乙醇溶液，在4 ℃条件下进行过夜处理，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集沉淀，用少量蒸馏水复溶，透析过夜（用蒸馏水作为透析液，隔2 h换一次透析液）；用Sevag法除去收集液中的蛋白质，再用活性炭和过氧化氢法除掉色素，即可得到粗EPS成品。

1.3.4 EPS分离纯化

将处理好的Sephadex凝胶颗粒一次完全装入用20%乙醇溶液清洗后的1 cm×50 cm层析柱里，然后静置，使凝胶自然沉降完全。

用去离子水将粗EPS进行复溶，然后吸取1 mL的复溶液上柱，进行层析，洗脱液为去离子水，洗脱力为重力洗脱，每隔5 min收集1管，一共收集30～46 管。用苯酚-硫酸法检测收集液体的EPS含量，按试管顺序分别从每管收集液中吸取1 mL，于490 nm波长处测定吸光度，以试管号为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出洗脱曲线。

1.3.5 发酵乳样品的制备

参照Khanal等[7]的方法，以10 g/100 mL的复原脱脂乳作为原料用乳进行发酵乳的制备。本实验分别以S. thermophilus+L. bulgaricus（1∶1）的复合菌株和菌株E. faeciumAS8为发酵菌种，接种量均为3%。37 ℃培养至pH值为4.7，4 ℃贮存5 d。发酵乳样品的详细参数见表1。

表1 发酵乳的制作Table 1 Manufacturing of fermented milk

1.3.6 流变学特性的测定

在Haake RS6000流变仪中以旋转和振荡模式进行发酵乳的流变学指标检测。系统温度设定在20 ℃，剪切速率为30 r/min时测定发酵乳的表观黏度。剪切速率从0 r/min增加到300 r/min，加速度相同但负值减小，直至剪切速率降为0。通过在固定频率（1 Hz）下的应力扫描，测试确定线性黏弹性区域。在线性范围内的应变（0.01%～100%）下评价储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。进行温度斜坡测试以确定黏弹性模量和温度之间的关系。实验以50 r/min的控制速率和6 ℃/min的加热速率，从4 ℃加热至30 ℃。每天对样品进行流变学特性的检测。

1.3.7 EPS结构测定

使用P e r k i n E l m e r傅里叶红外光谱仪，取200 mg KBr，研磨，压片，红外全扫描，结果作为背景；然后取EPS样品1 mg，加入200 mg KBr，研磨，压片，红外全扫描，扫描范围为400～4 000 cm－1。

1.3.8 EPS单糖组成测定

称取EPS 2 mg，用1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液水解90 min，经过旋转蒸发仪蒸干，加入2 mL甲醇，蒸干，重复2 次。残基加入2 mL双蒸水，60 mg硼氢化钠还原8 h，加入冰醋酸中和，用旋转蒸发仪蒸干，加入甲醇3 mL，反复3 次，旋蒸至得到粉末，在110 ℃烘箱烘干，然后加入1 mL乙酸酐乙酰化，100 ℃反应1 h，冷却，然后加入3 mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4～5 次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3 mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分振荡后，除去上层水溶液，如此重复4 次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10 mL待GC-MS分析。

GC-MS条件：Hp-5（Agilent 19091J-413）色谱柱（30 m×0.25 mm，320 μm）；程序升温条件为：起始温度120 ℃，以3 ℃/min升温至250 ℃；保持5 min；进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃，氢气流量30 mL/min，空气流量400 mL/min；载气为He，流速1 mL/min。

1.4 数据处理

实验数据利用Origin 7.5进行绘图，SPSS 16.0进行数据统计。

2 结果与分析

2.1 E. faecium AS8的EPS产量

图1 菌株E. faecium AS8生长、EPS产量及pH值随时间变化Fig. 1 Growth of E. faecium AS8, EPS production by E. faecium AS8 and change in pH value with fermentation time

图1显示活菌计数、pH值和EPS积累的时间过程。活菌数在20 h后达到其最大值（4.9×108CFU/mL），EPS的形成趋势与活菌计数的形成趋势相似。然而，E. faeciumAS8的EPS产量在24 h达到最大值，为69.81 mg/L。在随后的发酵过程中，EPS呈现下降的趋势。这是由于EPS属于次级代谢产物，菌株到对数末期及稳定期才开始大量的积累，但是随着菌株培养时间的延长，EPS会受到糖水解酶[8]和培养基物理参数改变的影响而发生降解[9]。

2.2 E. faecium AS8 EPS的分离及纯化

向EPS粗提液中加入Sevag液进行蛋白去除，于595 nm波长处测定吸光度为0。将已脱除蛋白质和脱色后的粗EPS用旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥所得粗EPS产量为1.68 g/L。由图2可以看到，AS8-EPS经过凝胶柱洗脱后出现了两个峰，分别出现在第9、29管和30管，因此初步判断AS8-EPS含有2 种多糖组分，分别收集峰I和峰II的洗脱液，进一步用Sephadex G-50进行纯化。由图3可以看到，峰I和峰II洗脱液经过凝胶柱后只出现一个峰，因此初步判断其为单一的多糖组分，分别命名为AS8-1-EPS和AS8-2-EPS。

图2 AS8-EPS Sephadex G-100凝胶柱洗脱曲线Fig. 2 Elution curve of AS8-EPS on Sephadex G-100 column

图3 AS8-EPS Sephadex G-50凝胶柱洗脱曲线Fig. 3 Elution curve of AS8-EPS on Sephadex G-50 column

2.3 发酵乳流变学特性

了解发酵乳的流变特性对于工艺设计、产品开发、加工和处理、质量控制和贮存非常重要[10]。G’值用于表示剪切过程中，存储在样品中的变形能量，并且表示样品的弹性行为[11]。图4显示在1 Hz频率下，不同发酵乳G’和G’’的平均值。所有发酵乳在贮存期间都表现出G’值大于G’’值的弱黏弹性凝胶特征，这与之前的一些结果相一致[10,12-13]。表明所有类型的酸奶都具有弹性或类似固体的特征[10]，EPS和酸奶凝胶形成的蛋白质网络之间具有相互作用。Gentès等[14]研究指出，这可能是EPS与酪蛋白和乳清蛋白的静电相互作用。相比对照及菌株AS8制备的发酵乳，分别添加AS8-1-EPS和AS8-2-EPS的发酵乳显示出较低的模量。EPS在与蛋白质相互作用时可以充当活性填料并增加黏弹性模量。凝胶形成之前，在乳中存在EPS会产生大孔隙，导致黏弹性模量降低。凝胶化后，EPS的产生似乎不影响网络的孔隙率，但可能导致硬度增加[12]。高浓度EPS可能促进了与蛋白质网络的更多不相容性[15]，这也可能是导致添加EPS发酵乳的G’值下降的原因。

触变环是指剪切应力与剪切速率曲线中，向上和向下曲线之间的区域，是进行黏弹性材料的剪切速率扫描时经常可观察到的，反映了食物结构破坏和重建所需能量之间的差异，与食物的触变性呈正比[16]。在食物结构被打破后，静置一段时间，触变性能可以通过重新获得其初始结构的能力被量化[17]。在已有研究中，新鲜酸奶的触变性已经被很好地确立[18-19]。对照组和分别添加AS8-1-EPS及AS8-2-EPS发酵乳的触变环相似，且面积大于菌种AS8发酵乳的面积（图5）。这表明前一发酵乳样品在上升周期中比其他发酵乳受到更多的结构破坏。黏度越高，触变环面积越大[20]。EPS的数量和类型以及它们在蛋白质网络中的相互作用和分布是影响网络结构的重要因素。与用菌株AS8制备的发酵乳相比，分别添加EPS的AS8-1-EPS和AS8-2-EPS发酵乳触变环面积相对较高，可能额外添加的EPS赋予连续相更多的聚合物样流变行为[12]。随着贮藏时间的延长，菌种AS8发酵乳触变环面积明显减小，添加AS8-1-EPS发酵乳的面积略有下降，表明添加EPS有助于提高发酵乳在贮藏期的稳定性。

图5 贮藏5 d内4 种发酵乳的触变环Fig. 5 Thixotropic loop of four different fermented milks during storage for 5 days

4 ℃贮存期间，稳定状态下测量发酵乳样品表观黏度如图6所示。与其他样品相比，菌株AS8发酵样品显着降低了发酵乳的表观黏度。然而外源添加EPS明显增加了样品的表观黏度，尤其添加AS8-2-EPS样品表观黏度最高。这与已有研究结果相一致[21-22,13]。贮存第4天时，分别添加AS8-1-EPS和AS8-2-EPS的发酵乳黏度值达到最高，随着贮藏期增加，黏度开始降低。表观黏度结果与触变性检测结果（图5）一致。

图6 贮藏期4 种发酵乳表观黏度变化Fig. 6 Comparison of apparent viscosity of four different fermented milks during storage for 5 days

李全阳等[23]研究指出，在形成发酵乳凝胶期间，EPS由乳酸菌缓慢代谢。酪蛋白开始凝集后，伴随着凝胶构建过程，乳酸菌原位产生的EPS具有空间屏障作用。随着EPS产量的逐渐增加和网络的干扰，酪蛋白的三维网络结构趋于一致。然而，当原奶中添加纯化的EPS时，大分子的EPS在酪蛋白聚集之前完成了原料乳的空间分割。在强烈的空间屏障作用下，酪蛋白的三维网络结构会不连续地形成，发酵乳的结构会变得非常薄弱。与之相似，本研究的流变特性检测结果显示，贮藏期间，添加AS8-1-EPS和AS8-2-EPS的实验组较菌株AS8组可增加发酵乳表观黏度及稳定性，能很好地维持发酵乳的热稳定性。

2.4 EPS单糖组成

与标准单糖保留时间相对照（表2），AS8-1-EPS鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的保留时间分别为15.921、16.621、17.626、27.7、28.22、28.653 min，其中甘露糖峰的长度、宽度以及峰面积最大，强度为164.6；葡萄糖的峰面积其次，强度为74.8；半乳糖的峰面积第3，强度为22；其余3 种糖的峰长度、宽度以及峰面积非常小，其强度也小，分别为4.1、6.1和4.4。确定AS8-1-EPS的单糖组成主要为甘露糖，还有一些葡萄糖和半乳糖，它们的物质的量占比为59.1%、26.8%、7.9%；含有非常少量的鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，它们的物质的量占比为1.7%、2.6%、1.9%。AS8-2-EPS的鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的保留时间分别为15.789、27.607、28.156 min和28.601 min，其中甘露糖峰的长度、宽度以及峰面积最大，强度为19。确定AS8-2-EPS的单糖组成为甘露糖和葡萄糖，含有少量的半乳糖和鼠李糖，它们的物质的量占比为65.4%、21.3%、8.9%、4.4%。实验菌株E. faeciumAS8所产2 种多糖的单糖组成与目前报道不同，Bajaj等[24]研究表明，E. faecium1.1、E.faecium2.0和E. faecium4.0 所产多糖为均一葡萄糖聚合物。而产自菌株E. faeciumMC13的多糖为杂多糖，主要单糖组成为半乳糖和葡萄糖[25]。

表2 标准样品出峰保留时间和AS8-EPS物质的量占比Table 2 Peak retention times of monosaccharide standards and molar percentages of AS8-EPS

2.5 EPS红外光谱

红外光谱用于确认多糖的结构特征和官能团[26]。在4 000～400 cm－1的区域内对EPS进行红外光谱检测。如图7所示，AS8-1-EPS在3 441.05～579.47 cm－1区域，AS8-2-EPS在3 350.06～407.81 cm－1区域内出现典型吸收峰。3 200～3 600 cm－1附近峰表明有大量的羟基（O—H）[27]，为糖类化合物。而AS8-1-EPS在2 923.55 cm－1和2 852.85 cm－1在处有—CH2和C=O的特征吸收峰。在1 652 cm－1附近的吸收峰（AS8-1-EPS：1 652.03 cm－1；AS8-2-EPS：1 650.85 cm－1）可以被认为是羧酸盐键的伸缩振动[28]。在1 400 cm－1处的峰（AS8-1-EPS：1 401.91 cm－1；AS8-2-EPS：1 403.15 cm－1）可能是由于COO—基团中C=O的对称伸缩[29]。1 210 cm－1和1 270 cm－1之间的峰（AS8-1-EPS：1 258.24 cm－1）与硫酸盐基团中S=O键的伸缩振动有关[30]。950～1 200 cm－1区域内的强吸收（AS8-1-EPS：1 060.91 cm－1；AS8-2-EPS：1 083.11 cm－1）主要由吡喃糖环醚键C—O—C和醇羟基—OH伸缩振动引起的[31]。此外，据报道，每种特定的多糖具有在1 200～1 000 cm－1范围内的特定带（AS8-2-EPS：1 195.26 cm－1），其由与C—O—H侧基的伸缩振动和C—O—C糖苷键振动重叠的环振动支配[32]。563～875 cm－1附近的峰（AS8-1-EPS：579.47 cm－1；AS8-2-EPS：601.66 cm－1和859.18 cm－1）表明有糖的部分存在[33]。579.47 cm－1处的吸收峰和601.66 cm－1处的吸收峰是C—C—O变形振动引起的，而407.81 cm－1处的吸收峰是C—C—C和C—C—O变形振动引起的[34]。在859 cm－1附近是吡喃糖β-型C—H变角振动的特征峰，由此可以推断AS8-2-EPS中有β-型糖苷键[34]，有报道显示，在879 cm－1和810 cm－1附近的吸收峰（AS8-2-EPS：859.18 cm－1）对应于甘露糖的存在[35]，这一结果与单糖组成分析相同（表2）。EPS的红外光谱显示AS8-1-EPS和AS8-2-EPS均为杂多糖。

图7 AS8-1-EPS（a）和AS8-2-EPS（b）红外光谱图Fig. 7 Infrared spectra of AS8-1-EPS (a) and AS8-2-EPS (b)

3 结 论

本研究采用Sephadex G-100柱、Sephadex G-50柱、红外光谱和GC-MS对E. faecium AS8所产2 种多糖进行分离纯化和鉴定，同时对其流变学特性进行研究。分别用菌株E. faecium AS8进行发酵及添加纯化后的AS8-EPS发酵乳流变学特性不同，发酵乳的流变学特性非常复杂，这种复杂性的主要因素是EPS浓度和EPS结构的变化，这决定了EPS与发酵乳中蛋白质网络的相互作用。本研究为进一步揭示乳蛋白与乳酸菌EPS的凝胶形成机理提供一定的参考。