颜阿娜，陈声漾，陈 旭，田永奇，付才力，汪少芸*

（福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

氧化在人体生命运转和食品加工贮藏中是一个由自由基介导的过程，对生物个体和食品都产生不利的影响[1]。当人体受到外界刺激时，产生过多的自由基，对细胞保护酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶）造成伤害，甚至损伤细胞，如氧化细胞蛋白质和膜脂质以及损伤DNA/RNA等[2-3]，进而引发机体或组织衰老[4-5]、癌症[6]和帕森斯综合症[7]等多种疾病。此外，在食品加工生产和贮藏过程中，食品营养成分氧化，不仅会引起食品品质下降，还有可能导致食品摄入者发生疾病[8-9]。因此，抗氧化剂在食品领域得以广泛应用。但常用的人工合成抗氧化剂往往会对人体产生不利的影响，具有一定的毒性和致癌作用，有些国家已经禁止在食品中添加合成抗氧化剂。因此，寻找安全性的抗氧化剂至关重要。抗氧化多肽是一种同时具备抗氧化和生物安全性高的肽类物质，是生物抗氧化剂的较好来源。海洋生物由于其特殊的生活环境，在适应环境的进化过程中，形成了独特的遗传代谢机制和防御机制，是目前获得抗氧化活性物质的主要来源之一[10]。目前已从海洋生物如牡蛎、虾、鱿鱼、紫贻贝以及其他鱼类中鉴定出具有抗氧化活性的多肽[11-14]。黑鲨，学名镰状真鲨（Carcharhinus falciformis），别称五羊、丝鲨，属于真鲨目，主要分布于热带和亚热带等海域。鲨鱼皮粗蛋白含量高达87.5%，脂肪含量仅0.15%，具有“高蛋白低脂肪”的特点[15]。江勇[16]从鲨鱼皮明胶水解物中分离纯化出3 个抗氧化肽，但其抗氧化机理尚未阐明。事实上，在抗氧化肽的相关研究中，主要集中于通过现代分离纯化手段，从蛋白水解物中分离得到抗氧化肽，并分析其氨基酸序列，虽有些涉及到抗氧化肽活性位点[17]、空间结构[18-19]和一级结构与功能[20]方面的研究，但其分子机制和抗氧化机理方面尚未彻底阐明。因此，本实验以黑鲨鱼皮为原料，采用蛋白酶水解制备抗氧化多肽，并进行分离纯化及结构鉴定，从化学的角度探究纯化肽清除自由基的作用机理和构效关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲨鱼皮由福建福州宏东远洋渔业有限公司提供。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合风味蛋白酶、胰蛋白酶 丹麦诺维信公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochlori，AAPH） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Gemini C18高效液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Phenomenex公司；MALDI SYNAPT Q-TOF高效液相色谱-飞行时间质谱仪 美国Waters公司；FD-3真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；SpectraMax i3x酶标仪 美谷分子公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 上海昂拉仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑鲨鱼皮前处理

将黑鲨鱼皮残余的鱼肉和脂肪去除，洗净，切成小块，然后置于50 ℃干燥箱中烘干至质量恒定，最后将烘干的黑鲨鱼皮用粉碎机粉碎成60 目的粉末，密封保存。

1.3.2 黑鲨鱼皮酶解工艺

鱼皮→去脂肪、清洗、切块→烘干→粉碎→加水→调节pH值→加酶水解→沸水灭酶15 min→离心→取上清液→冷冻干燥→冻干粉

1.3.3 抗氧化肽制备条件优化

采用以DPPH自由基清除率为主要指标、水解度为辅助指标的双指标检测方法，通过实验优化，筛选出最佳酶解工艺条件。分别考察酶解工艺条件中蛋白酶（中性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、复合风味蛋白酶和碱性蛋白酶）、pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、酶添加量（97、162、226、291、356 U/mL）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）、底物质量分数（1%、2%、3%、4%、5%）和酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）对鱼皮酶解工艺制备多肽的抗氧化活性和水解度的影响。表1是蛋白酶最适pH值和温度，考察最佳蛋白酶酶解工艺条件为5 种蛋白酶所对应的最适pH值和温度。

表1 蛋白酶最适pH值和温度Table 1 Optimum temperature and pH for proteases

1.3.4 响应面试验设计

在前期单因素试验结果的基础上，确定底物质量分数为3%，酶解温度为45 ℃。以pH值（A）、酶解时间（B）、酶添加量（C）为自变量，以水解度和DPPH自由基清除率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken设计3因素3水平试验，试验设计如表2所示。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Code and level of independent variables used for Box-Behnken dessiiggnn

1.3.5 抗氧化肽的分离纯化及鉴定

1.3.5.1 抗氧化肽的分离纯化

取适量黑鲨鱼皮蛋白肽冻干粉溶于去离子水，12 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤去杂质。样品进样量为100 μL，检测波长为214 nm，流速为4.0 mL/min；流动相A液为含0.05%三氟乙酸溶液，B液为0.05%三氟乙酸-乙腈溶液，以乙腈体积分数为0%～40%的梯度洗脱；分别收集各组分，并测定其抗氧化活性，收集具有较高抗氧化活性的组分，冻干并在－20 ℃保存备用。

1.3.5.2 新型抗氧化五肽的鉴定

通过反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分离得到抗氧化活性最高的组分，采用高效液相色谱-串联质谱进行氨基酸序列鉴定。色谱条件：流动相：0.1%乙酸的乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；检测波长：214 nm；色谱柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm）。质谱条件：正离子检测方式；母离子扫描范围m/z50～2 000；碰撞能量6 eV。所得的质谱经MaxEnt3和PepSeq软件分析鉴定，得到抗氧化肽氨基酸序列。

1.3.6 新型抗氧化五肽的合成

通过高效液相色谱-串联质谱鉴定的抗氧化肽，委托厦门博欣生物技术有限公司合成，纯度达到98%以上，后续实验所用到的抗氧化肽均为合成肽。

1.3.7 水解度的测定

酶解液水解度的测定参照甲醛滴定法[21]。1.3.8 体外抗氧化活性测定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力

参照Wu Huichun等[22]的方法测定，略有改动。取不同质量浓度样品1 mL与DPPH溶液（0.1 mmol/L，95%乙醇溶液配制）1 mL充分混匀，室温避光静置30 min，517 nm波长处测定吸光度；用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液为样品参比组；空白组为1 mL DPPH溶液与1 mL 95%乙醇溶液。样品的DPPH自由基清除率根据式（1）进行计算：

式中：Ai为样品组吸光度；Aj为样品参比组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.8.2 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）

参照You Juan等[23]的方法并稍加改进，采用96 孔板荧光测定。20 μL样品与80 μL磷酸盐缓冲液（75 mmol/L）以及50 μL荧光素FL溶液（200 nmol/L）混合，37 ℃恒温箱中避光保温15 min，反应结束后加入50 μL AAPH溶液（80 mmol/L），立即放置酶标仪读取荧光值。酶标仪设置激发波长为485 nm，发射波长为538 nm，每隔1 min读取荧光值，连续测定，共进行90 min。磷酸盐缓冲液代替样品作为空白对照。

ORAC值以Trolox当量（μmol/g）表示，使用浓度分别为0.94、1.9、3.8、7.5、15、30、60 μmol/L，绘制荧光猝灭曲线，并计算其积分面积（AUC）如式（2）所示，ORAC值用样品曲线斜率与Trolox曲线斜率之比表示。

式中：f0为0 min时荧光吸光度；fi为imin时荧光吸光度。

2 结果与分析

2.1 抗氧化肽制备条件优化

不同蛋白酶的酶切位点不同，同种蛋白底物与不同蛋白酶反应，其作用结果也不同[24]。5 种蛋白酶水解产物的水解度和DPPH自由基清除率有所差异（图1A），其中复合风味蛋白酶水解产物的水解度最大，碱性蛋白酶水解产物次之，酸性蛋白酶最弱，碱性蛋白酶水解产物DPPH自由基清除活性最强，酸性蛋白酶水解产物次之。以抗氧化活性为主要指标，水解度为辅助指标，综合考虑，最终确定碱性蛋白酶为制备黑鲨鱼皮抗氧化肽的最佳用酶。随着酶添加量的增加，酶解产物的水解度和DPPH自由基清除活性增大（图1B），当酶添加量大于291 U/mL时，DPPH自由基清除率增长趋势开始减缓，这可能是因为酶和底物的比例接近酶结合的最佳状态。因此，选择酶添加量为291 U/mL。

图1 酶种类（A）和酶添加量（B）对产物水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig. 1 Effect of enzyme type (A) and dosage (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

蛋白酶对pH值环境有选择性，偏离最适pH值，其活性下降，相应的水解度和抗氧化活性也会受到影响；当pH值为8.0时，水解度最大，当pH值大于8.5，酶解产物的水解度和抗氧化活性均下降（图2A）；pH值会影响底物的解离状态，从而影响水解情况及抗氧化活性[25]，因此，选择酶解pH值为8.5。酶解时间大于5 h，水解度和DPPH自由基清除率上升缓慢（图2B）；这可能是因为在水解后期，蛋白酶作用的底物减少，酶切位点减少，酶对底物的作用基本结束[26]，因此，酶解时间选5 h为宜。

图2 pH值（A）和酶解时间（B）对产物水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig. 2 Effects of pH (A) and hydrolysis time (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

底物质量分数大于3%，水解度增加不明显，底物质量分数大于4%时，DPPH自由基清除率出现下降趋势（图3A）；这可能是因为底物质量分数过高，反应体系黏度大，酶分布不均，底物不能完全酶解[27]，因此，确定底物质量分数3%为最佳反应条件。碱性蛋白酶在45 ℃的酶解产物表现出最佳水解度和DPPH自由基清除率（图3B）。因此，最终确认黑鲨鱼皮蛋白水解条件为：选择碱性蛋白酶、pH 8.5、酶添加量291 U/mL、底物质量分数3%，酶解温度45 ℃、酶解时间5 h。在此条件下，所得的抗氧化肽DPPH自由基清除率IC50为3.19 mg/mL。

图3 底物质量分数（A）和酶解温度（B）对产物水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig. 3 Effects of substrate concentration (A) and temperature (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

2.2 回归方差及交互作用分析

以DPPH自由基清除率为主要指标（Y1），以水解度为辅助指标（Y2），通过响应面分析，考察pH值、酶解时间和酶添加量对黑鲨鱼皮酶解产物DPPH自由基清除率和水解度的影响，将试验产生的结果用Design-Expert 8.0.6软件模拟模型，得出二次回归模型方程：

Y1=127.07－28.37A－1.09B+14.06C+1.92AB+0.52AC－0.33BC+0.65A2－1.17B2－0.72C2

Y2=103.80－17.50A－11.46B+1.68C+1.55AB－0.21AC－0.03BC+0.69A2－0.06B2+0.05C2

表3 模型回归方程方差分析（DPPH自由基清除率为响应值）Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of quadratic polynomial regression equation with DPPH radical scavenging capacity as response value

表4 模型回归方程方差分析（水解度为响应值）Table 4 ANOVA of quadratic polynomial regression equation with DH as response value

回归方程的方差分析和显著性检验结果见表3和表4。两个模型的P值小于0.000 1，说明两个模型极显著，可用于鲨鱼皮蛋白酶解效果的分析和预测。因素B、C、AB对水解度的影响高度显著，因素A、C、C2对DPPH自由基清除率的影响高度显著，因素AB、B2对DPPH自由基清除率的影响极显著。表明pH值和酶解时间对水解度的主效应明显，并且两者之间存在交互作用。

利用软件对响应面进行优化分析，可得鲨鱼皮最佳酶解工艺为酶解温度45 ℃、底物质量分数3%、pH 8.0、酶解时间4.9 h、酶添加量311 U/mL，重复5次实验，测得水解度为（14.21±0.04）%，DPPH自由基清除率为（77.61±0.12）%，与预测值接近，从而确认了最佳酶解条件。

2.3 抗氧化肽的分离纯化

将冷冻干燥的黑鲨鱼皮酶解产物经过RP-HPLC分离纯化，结果如图4所示。黑鲨鱼皮酶解产物共洗脱出26个组分，分别测定其DPPH自由基清除率，如图5所示，不同组分对DPPH自由基的清除率有所差异，其中F19组分的DPPH自由基清除率最大。因此，将活性最高的F19组分做下一步的分离鉴定。

图4 黑鲨鱼皮抗氧化肽分离RP-HPLC图Fig. 4 RP-HPLC separation of antioxidant peptides derived from black shark skin

图5 RP-HPLC分离黑鲨鱼皮抗氧化肽各组分的DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides separated from black shark skin hydrolysate by RP-HPLC

2.4 抗氧化五肽的鉴定分析

图6 一级质谱的总离子流图Fig. 6 Total ion current chromatogram for F19

将F19组分经高效液相色谱-串联质谱鉴定，其一级质谱的总离子流图即飞行时间质谱做检测器的色谱图，如图6所示。选择抗氧化活性高的色谱峰（保留时间为10.02 min左右）进行一级质谱和二级质谱分析，以获得纯化的新型抗氧化肽分子。

图7为抗氧化肽一级质谱ESI-MS图，m/z462为其分子离子峰[M+H]+的离子信号，m/z923为[2M+H]+的离子信号，因此可以计算出纯化抗氧化肽的分子质量为461 Da。

图7 抗氧化肽一级质谱图Fig. 7 Mass spectrum of F19

对一级质谱中m/z462离子信号做二级质谱分析，二级质谱数据结果通过MaxEnt3和MasSeq软件分析出肽段的序列信息，结果如图8所示。经鉴定，所分离纯化的多肽为一种新型抗氧化五肽，其氨基酸序列为Pro-Gly-Gly-Thr-Met（PGGTM）。

图8 抗氧化肽的二级质谱图Fig. 8 MS/MS spectrum of F19

2.5 抗氧化五肽的活性表征及可能作用机理

表5 Pro-Gly-Gly-Thr-Met的抗氧化活性Table 5 Antioxidant activity of Pro-Gly-Gly-Thr-Met in comparison to BHT

纯化五肽Pro-Gly-Gly-Thr-Met的抗氧化活性如表5所示，Pro-Gly-Gly-Thr-Met的DPPH自由基清除率为75.01%（肽质量浓度1.0 mg/mL），ORAC值为2 490.01 μmol/g。因此，Pro-Gly-Gly-Thr-Met具有抗氧化活性。

纯化五肽Pro-Gly-Gly-Thr-Met中，Pro是胶原蛋白特有的氨基酸，有文献表明Pro在肽类抗氧化活性中起到重要的作用[10]，其清除自由基过程可能为环类氨基酸Pro提供质子给自由基，并且两个带有自由基的Pro能够自身反应，阻止了自由基链式传递[28-29]（图9）。疏水性氨基酸如Met能增强多肽的抗氧化活性，Met被活性氧快速氧化成甲硫氨酸亚砜，消耗周围的氧，起到抗氧化作用[30]。因此，Pro-Gly-Gly-Thr-Met具有抗氧化作用，其中N端的Pro和C端的Met可能起到关键性作用。

图9 Pro-Gly-Gly-Thr-Met清除DPPH自由基机理图Fig. 9 Schematic illustration of the reaction mechanism between Pro-Gly-Gly-Thr-Met and DPPH radical

3 结 论

以DPPH自由基清除率为主要指标，以水解度为辅助指标，采用单因素试验优化制备黑鲨鱼皮抗氧化肽，得到最优的制备条件为：碱性蛋白酶在pH 8.0、酶添加量311 U/mL、底物质量分数3%条件下，于45 ℃恒温摇床反应4.9 h。获得纯化的新型抗氧化分子Pro-Gly-Gly-Thr-Met，其具有抗氧化活性，其中N端的Pro和C端的Met可能是抗氧化关键性作用位点。