刘贝贝，陈微微，张雯婧，刘庆华

(中南民族大学生命科学学院，医学生物研究所 & 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北 武汉 430074)

过敏性哮喘是一种慢性呼吸道疾病[1]。气管平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)是呼吸系统中一种重要的细胞类型，参与哮喘的发生。ASMCs过度收缩会导致气道管腔狭窄，限制气体交换，严重时可威胁哮喘患者的生命[2]。ASMCs的收缩和舒张与细胞内Ca2+浓度密切相关，Ca2+浓度受钙通道影响，如L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+channel，LVDCC)和钙库操纵性钙通道[3]。已有研究表明，LVDCC的选择性抑制剂硝苯地平(nifedipine)可以有效缓解哮喘患者症状[4]。目前临床上治疗哮喘多以化学药物(如β2肾上腺素能激动剂)为主，但长期使用容易产生药物依赖性等副作用[5]。而中国的传统中药由于其毒副作用相对较小，安全性高，逐渐受到人们关注。本课题尝试从中药成分中寻找更合适的治疗哮喘新药。

异莲心碱(isoliensinine)，一种双苄基喹啉生物碱单体，是中药莲子心的一种活性成分[6]。异莲心碱在心血管疾病方面的药理作用研究较多，发现其具有阻滞钙通道、抗心律失常、抗高血压和心肌肥厚以及抗血小板凝集等作用[7-8]。此外，异莲心碱在抗氧化、抗肿瘤和抗细胞增殖等方面亦有一定作用[9-10]。鉴于异莲心碱对心肌和血管平滑肌具有广泛的舒张作用，我们推测它对气管平滑肌(airway smooth muscle，ASM)也可能具有舒张作用。因此，本研究尝试探究异莲心碱对高K+诱导预收缩的小鼠离体ASM的舒张作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级BALB/c小鼠，雄性，6～8周龄，体重18～20 g，购自华中农业大学实验动物中心，许可证号为SCXK(鄂)2015-0019。饲养于中南民族大学实验动物中心1周后用于实验。

2 主要试剂

异莲心碱单体购自中国药品生物制品检定所；氯化四乙胺、HEPES、硝苯地平、DMSO、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和Mg-ATP均购自Sigma；Fura-2/AM购自Invitrogen。

3 主要仪器

JH-2型张力换能器(成都泰盟)；HV-4离体组织器官恒温灌流系统(成都泰盟)；EPC-10膜片钳放大器(HEKA)；钙成像系统(TILL Photonics)。

4 方法

4.1气管环张力的测量 体外分离小鼠气管环，利用张力换能器测ASM张力[11-12]。小鼠处死后迅速分离出气管，并快速转移到预冷的PSS生理溶液中。PSS(mmol/L)：135 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES、10葡萄糖，pH 7.40。从气管底部剪取一段气管环(约5 mm)，将其悬挂于灌流槽中，一端连接张力换能器，灌流槽盛有PSS，并维持37 ℃、通氧。平衡60 min后，利用高K+(PSS中含80 mmol/L K+)预刺激3次，使气管环到达最佳收缩状态，然后开始正式实验。计算气管环的舒张比率,气管环的舒张比率(%)=(加入激动剂后平台期张力值-加入某浓度药物后平台期张力值)/(加入激动剂后平台期张力值-静息张力值)×100%。

4.2单个气管平滑肌细胞的分离 按参考文献中的方法分离小鼠ASMCs[13-14]。分离小鼠气管并将其转移到预冷的ASM解离液中。解离液(mmol/L)：120 NaCl、1.2 MgCl2、0.1 CaCl2、5.2 KCl、10 HEPES、11葡萄糖、0.6 KH2PO4、25 NaHCO3，pH 7.10。在体式显微镜下进一步分离得到ASM肌条，然后将ASM肌条转移至2 g/L木瓜蛋白酶消化液中，35 ℃水浴孵育25 min，其间轻微振荡2～3次。之后将肌条转移至1 g/L胶原蛋白酶消化液中，35 ℃水浴孵育7 min。最后，将酶解好的肌条转移到1 g/L BSA溶液中，洗脱2次后轻轻吹打使单个细胞释出，置于0 ℃保存备用。

4.3LVDCC电流的测量 以Ba2+为电荷载体，利用膜片钳放大器记录LVDCC电流[15]。细胞外液(mmol/L)：105 NaCl、6 CsCl、27.5 BaCl2、11葡萄糖、10 HEPES、10 TEA-Cl，pH 7.40。电极内液(mmol/L)：130 CsCl、10 EGTA、4 MgCl2、4 Mg-ATP、10 HEPES，pH 7.40。全细胞记录程序：钳制电压为-70 mV，从-70 mV去极化至+40 mV，去极化时间为500 ms，每10 s增加10 mV。电流利用PatchMaster软件分析。

5 统计学处理

采用Origin 8.0软件(OriginLab)对数据进行统计分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示。两组数据间的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学显著性。

结 果

1 异莲心碱对高K+诱导的小鼠离体ASM预收缩的舒张作用

高K+可诱导细胞膜去极化，LVDCC通道开放，胞外Ca2+内流，导致ASM发生收缩[17]。加入高K+溶液后，张力迅速上升，待张力稳定后，加入异莲心碱，使其浓度依次达到0.316、1、3.16、10、31.6和100 μmol/L，张力随着异莲心碱浓度的递增而递减，当浓度达到100 μmol/L时，张力降低至高K+预收缩前的基线水平，见图1A。在对照实验中，舒张现象不明显,见图1B。基于量效曲线，异莲心碱的最大舒张比率为(95.3±3.9)%，IC50值为(21.2±4.0)μmol/L，其诱发的舒张明显大于对照组(P<0.01)，见图1C。高K+诱导的预收缩也可被硝苯地平(LVDCC抑制剂)抑制，最大舒张百分比为(97.4±1.4)%，见图1D。然而，异莲心碱对静息状态下的ASM没有舒张作用,见图1E。

Figure 1.The effect of isoliensinine on high K+-induced precontraction in ASM. A: a tracheal ring was contracted by high K+, which was inhibited by isoliensinine in a dose-dependent manner; B: a control experiment; C: the dose-relaxation curves; D: the high K+-induced contraction was inhibited by nifedipine in tracheal ring; E: isoliensinine had no effect on the resting tension in tracheal ring. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsvehicle group.

图1 异莲心碱对高K+诱导预收缩ASM的影响

2 异莲心碱阻断LVDCC电流

为了进一步验证异莲心碱对ASMCs膜上Ca2+通道的影响，我们利用膜片钳全细胞记录技术检测了异莲心碱对LVDCC电流的影响。结果表明，当电压达到-20 mV时，LVDCC开始激活，介导内向电流，随着电压升高，内向电流逐渐增大，当电压为+10 mV时，电流达到峰值，然后随着电压的升高，电流逐渐减小。当加入异莲心碱或硝苯地平后，LVDCC电流完全消失,见图2。这些结果表明异莲心碱与硝苯地平均可阻断LVDCC电流。

3 异莲心碱对高K+引起的ASMCs[Ca2+]i升高的影响

利用钙成像系统检测ASMCs [Ca2+]i变化，其值由Ca2+荧光探针Fura-2的340/380 nm荧光信号比值代表。静息状态时[Ca2+]i维持在比较低的水平，加入高K+后，[Ca2+]i迅速升高，随之下降到一个平台期，当加入异莲心碱(100 μmol/L)后[Ca2+]i降低至基线。异莲心碱加入前Fura-2的340/380 nm荧光信号比为0.63±0.10，加入后为0.36±0.05(P<0.01),见图3A。如果在[Ca2+]i最高点加入异莲心碱(100 μmol/L)也可导致[Ca2+]i快速降低至基线。加药后340/380 nm荧光信号比由0.74±0.02降至0.42±0.05(P<0.01)，见图3B。这些结果提示异莲心碱可抑制LVDCC介导的[Ca2+]i升高。

Figure 2.The effect of isoliensinine on LVDCC-mediated currents. A: the protocol used to measure LVDCC currents; B: LVDCC currents were recorded, which were abolished by isoliensinine and nifedipine, respectively; C:I-Vcurves were plotted. Mean±SEM.n=6.

图2 异莲心碱对LVDCC电流的影响

Figure 3.Isoliensinine inhibits high K+-induced [Ca2+]iincreases. A: high K+induced a sustained increase of [Ca2+]iin a tracheal smooth muscle cell, which was inhibited by isoliensinine. The amplitudes at sites a1and b1were calculated. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vsa1group. B: the same experiments and analysis were performed, except isoliensinine was added at the peak point of [Ca2+]i, the amplitudes at sites a2and b2were calculated also. Mean±SEM.n=18.##P<0.01vsa2group.

图3 异莲心碱抑制高K+诱导的[Ca2+]i升高

4 异莲心碱抑制Ca2+内流触发的收缩

高K+导致膜电位去极化，激活LVDCC，介导Ca2+由胞外流入胞内。异莲心碱是否抑制高K+引起的Ca2+内流呢？在细胞外Ca2+为0的条件下(PSS中不含Ca2+但含0.5 mmol/L EGTA)，高K+不能诱导ASM收缩，而当Ca2+浓度恢复到2 mmol/L后，ASM立即收缩，最大收缩百分比为(107.4±6.6)%，而异莲心碱加入后，收缩被抑制,见图4A，最大抑制百分比为(86.2±4.7)%，见图4C。利用异莲心碱重复上面的实验，2 mmol/L Ca2+仅诱发小幅度的收缩，见图4B，其最大收缩百分比为(13.1±8.3)%，见图4C。两最大收缩百分比之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。这些结果证明异莲心碱抑制高K+引起的Ca2+内流。

Figure 4.The effect of isoliensinine on Ca2+influx induced by high K+. A: under Ca2+free conditions, high K+failed to induce a contraction in a tracheal ring. Following the addition of 2 mmol/L Ca2+, a contraction (the amplitude is represented by “a3”) occurred and then inhibited by isoliensinine; B: in the presence of isoliensinine, 2 mmol/L Ca2+-induced contraction was markedly inhibited. The amplitude is represented by “b3”; C: the summary results. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsa3group.

图4 异莲心碱对高K+诱导的Ca2+内流的影响

讨 论

气道高反应是哮喘的典型病理特征之一，本质上是由于ASM异常过度收缩所致[18]。目前利用药物抑制ASM收缩是缓解哮喘症状的一种有效治疗方法。ASM收缩反应与[Ca2+]i密切相关，胞质中的Ca2+与钙调蛋白结合，进而诱发ASM的收缩，而[Ca2+]i可受控于Ca2+通道的开放和关闭，其中LVDCC是一种介导Ca2+内流的通道[19-20]。因此，可利用体外实验筛选LVDCC的抑制剂，作为新的气管扩张剂的前体。

生物碱普遍存在于动物、植物和微生物等生物有机体中，根据化学结构的不同可分为异喹啉类、喹啉类和吲哚类等[21]。大多数生物碱具有抗炎、降低血压等多种药理学作用[22]。异莲心碱属于喹啉类生物碱单体，具有舒张心肌和肠系膜血管平滑肌的作用[23]，但在舒张ASM方面尚未见报道。本研究利用高K+作为激动剂刺激ASM收缩，体外模拟哮喘发病时的气管过度收缩，探究异莲心碱是否可舒张收缩的ASM，同时探究其作用机理。实验结果表明：在组织水平，异莲心碱不改变静息状态下的ASM张力，但可以舒张高K+预收缩的ASM，且舒张作用表现出剂量依赖性；在细胞水平，异莲心碱完全阻断LVDCC电流，同时显著降低高K+诱导升高的[Ca2+]i，抑制细胞外Ca2+流入胞内诱发的收缩。

综上所述，异莲心碱可抑制LVDCC通道，其介导的Ca2+内流停止，[Ca2+]i降低，导致ASM舒张。本研究结果提示异莲心碱可被开发为新的气管扩张剂。