梁 莹，李剑波，邵欣宁，林 柳，雷 鸣△

(1广州市第八人民医院肾内科，广东 广州 510060;2中山大学附属第一医院肾内科，广东 广州 510080)

侵袭和转移是影响肾癌患者整体预后的重要因素。尽管目前肾癌包括手术、放化疗在内的治疗方式和效果长足进展，但肾癌患者的总体预后并不能令人满意。超过30%的肾癌患者会发生转移[1]。侵袭转移也是导致肾癌进展、复发和致死的主要原因，严重影响患者的疗效和生存质量。因此，深入研究肾癌转移的发生机制，寻找可以有效干预肾癌转移的分子靶点，是提高肾癌患者疗效和改善其预后的有效途径[2-3]。学术界普遍认为，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程在肾癌等恶性肿瘤的侵袭转移中具有重要作用，因此探寻其中与肾癌转移相关的分子，有助于丰富对于肾癌转移机制的认识，开发针对肾癌EMT的有效治疗靶点，对实现抑制肾癌的侵袭转移具有科学意义[4]。近年来研究表明，微小RNA(microRNA, miR)-145与多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系，可能通过多种分子生物途径发挥抑癌作用有望成为肾癌的基因治疗靶点[5]。然而，在对肾癌进行miR-145靶向基因治疗后，对肾癌细胞上皮-间充质转化和侵袭转移的影响及其机制尚不明确[6]。本研究对miR-145的靶基因进行生物信息学预测后提示，与多种恶性肿瘤生物学行为相关的解整联蛋白-金属蛋白酶28(a disintegrin and metalloproteinase 28，ADAM28)可能是其在细胞中的作用靶蛋白[7]。本项工作采用miR-145模拟物(miR-145 mimics)转染人肾癌细胞系A-498细胞，观察其对肾癌细胞上皮-间质转化过程的影响，进而通过研究其对EMT相关功能蛋白及ADAM28蛋白表达水平的影响，进一步明确其分子生物学机制。

材 料 和 方 法

1 材料

miR-145 mimics及其阴性对照(mimic negative control, MNC)、miR-145 及内参照RNU6的PCR引物、双萤光素酶检验试剂盒、野生型的WT-ADAM28 psiCHECKTM-2载体及3’UTR定点突变后的MT-ADAM28 psiCHECKTM-2载体和3’UTR定点突变的ADAM28过表达质粒载体购自广州爱科生物技术有限公司。DMEM高糖培养液和胎牛血清购自GIBCO;转染试剂脂质体2000购自Invitrogen; Transwell小室购自NUNC; real-time PCR和逆转录-聚合酶链反应试剂盒购自TaKaRa。兔抗人ADAM28、兔抗人波形蛋白(vimentin)、兔抗人E-钙黏蛋白(cadherin)和兔抗人β-肌动蛋白(actin)抗体购自Abcam。肾癌细胞株A-498购自美国模式培养物集存库(ATCC® Number: HTB-44TM)。

2 方法

2.1miRNA转染和RT-qPCR检测 以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液常规培养A-498肾癌细胞株。按照转染试剂脂质体2000试剂说明书，在细胞融合度约60%时以miRNA mimics终浓度为65 nmol/L转染miR-145 mimics和MNC，分别作为M145和MNC组转染48 h;以未转染A-498细胞作为空白对照(mock control, MC)组。TRIzol法提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。以U6 snRNA为内参照，进行RT-qPCR检测。miR-145的正向引物序列为 5’-ACACTCCAGCTCCATGGGGGTTTTCCCAGGA-3’，反向引物序列为5’-CTCAACTGAGTCGGTGGGCAGTTGAGAGGGATTC-3’；U6的正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR条件为： 92 ℃ 35 s; 92 ℃ 5 s, 57 ℃ 38 s, 52个循环。循环延伸末端收集荧光信号，所得数据用2-ΔΔCt法进行分析计算。

2.2Transwell法检测细胞侵袭能力 将Matrigel稀释后，每个Transwell小室加入45 μL，37 ℃凝固2 h。分组转染后，各组细胞分别取对数期0.8×105个细胞160 μL无血清培养液重悬后加入Transwell小室上室。Transwell下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。细胞培养箱37 ℃常规培养48 h，清除上室底膜未穿膜上室细胞，甲醇固定穿膜上室细胞20 min，PBS冲洗。1%结晶紫染色30 min，PBS冲洗。显微镜下观察上室底膜，计数穿过小孔细胞[8]。

2.3miR-145靶基因预测 运用生物信息学方法明确miRBase数据库中搜索hsa-miR-145基因的序列, 进而分析miR-145序列的特征并预测其靶基因。

2.4Western blot法检测细胞蛋白表达的变化 肾癌细胞分组转染后48 h，按照既往报道方法收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot检测，分析ADAM28、波形蛋白、E-钙黏蛋白和内参照β-actin蛋白的表达[8]。

2.5ADAM28过表达对miR-145抑制EMT的拮抗作用 采用ADAM28过表达质粒转染M145组细胞系，并通过Western blot检测ADAM28过表达后M145组A-498细胞中ADAM28和EMT相关蛋白的表达情况。

2.6双萤光素酶报告基因实验检测miR-145与ADAM28的关系 采用野生型的ADAM28 psiCHECKTM-2载体及定点突变后的ADAM28 psiCHECKTM-2载体，分别和miR-145 mimics一起通过脂质体共转染，转染48 h后检测萤光素酶相对活性。

3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组之间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-145 mimics转染对A-498细胞miR-145水平的影响

转染A-498细胞48 h后，RT-qPCR检测各组细胞中miR-145的表达水平。结果显示，与MC组相比，M145组miR-145的表达水平显著上调(P<0.05)，而MNC组的miR-145表达水平与MC组差异没有统计学意义(P>0.05)，见图1。

Figure 1.RT-qPCR was used to detect the expression of miR-145 in renal carcinoma A-498 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

图1 RT-qPCR检测各组A-498肾癌细胞中miR-145的表达水平

2 miR-145对A-498细胞侵袭能力的影响

Transwell实验中，经过48 h培养，观察受到染色的穿膜细胞数量。结果显示，M145组侵袭细胞数量显著低于MC组(P<0.05)，而MNC组的细胞数量与MC组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

3 miR-145对A-498细胞EMT相关功能蛋白表达的影响

Figure 2.The invasion ability of A-498 cells in each group was detected by Transwell assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

图2 Transwell实验比较各组A-498细胞侵袭能力

Western blot实验显示，与MC组相比，M145组vimentin蛋白表达量显著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达量显著升高(P<0.05)，而MNC组与对照组之间的蛋白表达无显著差异(P>0.05),见图3。

Figure 3.Western blot assay was used to detect the expression level of EMT-related proteins in A-498 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

图3 Western blot实验检测各组A-498细胞EMT相关蛋白表达水平

4 miR-145靶基因的预测

miRBase生物信息学预测结果表明，miR-145与ADAM28的3’-UTR部分互补，ADAM28可能是miR-145的靶基因,见图4。

Figure 4.Bioinformatic prediction results of miR-145 target genes from bioinformatics prediction.

图4 miR-145靶基因生物信息学预测结果

5 miR-145对A-498细胞ADAM28蛋白表达的影响

Western blot实验显示，与MC组相比，M145组ADAM28蛋白表达量显著降低(P<0.05)，ADAM28蛋白表达量的Western blot结果与miR-145的表达水平表现出负相关关系。而MNC组与MC组之间的ADAM28蛋白表达无显著差异(P>0.05)，见图5。

Figure 5.Western blot assay was used to detect the expression level of ADAM28 protein in A-498 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

图5 Western blot实验检测各组A-498细胞ADAM28蛋白表达水平

6 ADAM28过表达对miR-145抑制肾癌细胞EMT的拮抗效果

Western blot实验检测到，相比单纯miR-145 mimic转染组细胞，采用ADAM28过表达质粒联合转染后的M145组细胞ADAM28表达量升高(P<0.05)，同时，细胞中vimentin蛋白表达量显著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图6。

Figure 6. The effect of miR-145 on the expression of EMT-rela-ted proteins in A-498 cells with or without ADAM28 over-expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsM145 group.

图6 ADAM28过表达拮抗miR-145对A-498细胞EMT相关功能蛋白表达的影响

7 miR-145与ADAM28相互作用关系的双萤光素酶报告基因实验检测

双萤光素酶报告基因实验结果显示miR-145能显著抑制野生型WT-ADAM28 psiCHECKTM-2载体的发光强度(P<0.05)，而无法抑制3’UTR定点突变型MT-ADAM28 psiCHECKTM-2载体的发光强度(P>0.05)，见图7，说明ADAM28为miR-145的下游靶基因。

Figure 7.The relative luciferase activity of ADAM28. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

图7 ADAM28的萤光素酶活性比较

讨 论

miR-145的基因定位于染色体5q32，与miR-143组成一个转录单位，生成同一个前体，经过内切酶剪切后形成[9]。miR-145在人体内子宫、卵巢、睾丸、前列腺、脾脏和心脏等组织器官中高表达，而在宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌和脑垂体瘤等低表达[10]。所以，miR-145有可能在肾癌发生、发展中扮演抑癌基因的作用[6]。本研究尝试采用miR-145 mimics实现对人肾癌细胞A-498中miR-145的过表达，进而检测到对肾癌细胞侵袭能力的抑制，说明miR-145高表达具有对人肾癌细胞A-498侵袭能力的抑制效果。

既往研究表明，miR-145与多种恶性肿瘤的上皮-间质转化过程密切相关。EMT在肿瘤迁移和侵袭的发生这一多因素多步骤的动态过程中起重要作用，是肿瘤侵袭转移的重要分子生物学机制[11]。EMT是胚胎发育及肿瘤侵袭转移中，上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，主要表现为细胞黏附分子(如上皮标志物E-cadherin)表达减少及间充质标志物(如vimentin)表达增多等。为明确miR-145抑制肾癌细胞迁移能力和侵袭能力是否是通过对A-498细胞的EMT调控实现的，本研究对EMT相关功能蛋白进行了检测，结果表明，miR-145过表达后，vimentin蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达量显著升高，提示miR-145实现了对EMT过程的抑制，进而进行了对肾癌细胞迁移能力和侵袭能力的抑制。

MicroRNA的主要作用机制是与靶蛋白mRNA的3’-UTR形成互补配对，进而使其降解，抑制靶蛋白的表达。对靶基因正确进行准确的预测与鉴定，是研究microRNA生物学功能的基础和关键。对目的microRNA进行生物信息学分析，能够迅速预测出可能的靶基因作用位点，但是根据不同原则寻找靶基因，均可能出现假阳性和假阴性的预测结果。所以生物信息学软件预测靶基因后，可以进一步采用生物学实验方法进行验证，以进一步研究其生物学功能[12]。本研究的生物信息学预测结果提示，ADAM28为miR-145的潜在靶基因，且其热稳定型和基因保守性较高。然而，单纯从miR-145和下游靶基因基因序列上的相互作用预测模型的数据库中并不能确切推断其具体的生物学功能，及具体起效的靶蛋白。所以，在预测靶蛋白之后，必须对miR-145和靶基因的调控机制进行基因表达层面和功能调控层面的验证。如果能够通过生物学实验证实两者的直接调节关系，将有助深入了解miR-145在肾癌细胞的增殖、分化和凋亡以及与肾癌的发生、发展机制。ADAM28是ADAM家族的重要成员之一，由多个结构域组成，包括前肽、金属蛋白酶、表皮生长因子样结构域、跨膜结构域和细胞质尾结构域等。与其它ADAM相比，ADAM28是通过在细胞表面形成成熟的跨膜结构域后，通过特异性自催化过程激活的[13]。报道显示，ADAM28参与包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌和白血病在内的很多恶性肿瘤的生长和转移，在恶性肿瘤细胞中，对其进行靶向治疗可能具有重要临床意义[7，13]。本研究观察到，对miR-145作用于肾癌细胞后，抑制ADAM28蛋白表达的效果显著，细胞中的ADAM28蛋白表达水平显著降低，这个结果促使我们对ADAM28是否是miR-145的靶蛋白进行进一步的深入探索。

我们构建了3’-UTR突变的ADAM28过表达质粒，使其转染高表达miR-145的A-498细胞。伴随ADAM28表达量的升高，细胞中vimentin蛋白表达量显著升高，E-cadherin蛋白表达量显著降低，说明3’-UTR突变后引起的ADAM28过表达可以实现对miR-145抑制EMT的拮抗作用。我们进而通过双萤光素酶检验结果对两者的直接相关关系进行探索，观察到miR-145只能抑制野生型WT-ADAM28 psiCHECKTM-2载体的发光强度，而无法抑制3’UTR定点突变后的MT-ADAM28-psiCHECKTM-2载体的发光强度，说明ADAM28为miR-145直接的下游靶基因。

综上所述，miR-145可能通过降低下游靶基因ADAM28水平影响EMT相关蛋白表达，进而抑制人肾癌细胞A-498的EMT功能，有可能成为肾癌基因治疗的良好靶点。