杨涛玮，汪帮琦，胡卫列△

(1南方医科大学，广东 广州 510515；2中国解放军南部战区总医院泌尿外科，广东 广州510010)

肾上腺皮质癌(adrenal cortical carcinoma，ACC)是一种起源于肾上腺皮质的恶性肿瘤，每年发病率约为0.5～2.0/100万人，该病起病隐匿，恶性程度高，侵袭力强，容易向肝脏、肺、后腹膜及淋巴转移[1-3]。完全性手术切除是早期ACC治疗的重要手段，但术后复发率高，即使完全切除肿瘤，患者5年生存率仅为30%。ACC缺乏有效的药物治疗，目前国内外推荐最有效的药物米托坦，其有效率仅为35%，且仅能短暂减缓肿瘤进展速度[4]。

阿昔替尼(axitinib)为小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可靶向作用于血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，具有抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤细胞生长的作用[5-6]。目前临床上阿昔替尼主要用于肾癌的治疗，少有在ACC治疗中应用。本文研究阿昔替尼是否可抑制人肾上腺皮质癌SW-13细胞的生长，并探究其作用机理，为阿昔替尼临床用于ACC治疗提供科学依据。

材 料 和 方 法

1 细胞株

人肾上腺皮质癌SW-13细胞购自上海中科院细胞库。

2 主要试剂

阿昔替尼购自MedChemExpress；L-15培养基(杭州吉诺公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、青霉素和链霉素(Gibco)；CCK-8细胞活力检测试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Dojindo)；细胞周期检测试剂盒(武汉碧云天公司)；兔抗人β-actin、兔抗人VEGFR 2、p-ERK 1/2和ERK1/2 抗体(Abcam)。

3 主要方法

3.1细胞培养 人肾上腺皮质癌SW-13细胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的L-15培养基、接种于25 cm2培养瓶，在37 ℃、无CO2恒温培养箱培养。待细胞密度处于70%～80%时进行传代；用对数生长期的细胞进行实验。一般2 d换液，4 d细胞传代。

3.2CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的SW-13细胞以2.5×107/L密度接种于96孔板中，每孔含培养液100 μL，设置5个药物实验组(阿昔替尼浓度分别为0.1、1、2.5、5、10和20 μmol/L)、1个正常对照组和1个空白组，每组4个复孔。在受试物处理24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，避光反应4 h，用酶标仪检测各孔在450 nm波长的吸光度(A)值，以空白对照孔调零，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A实验组-A空白组)/(A正常对照组-A空白组)×100%。实验独立重复3次。

3.3流式细胞术检测细胞周期 将细胞接种传代于6孔板中，每孔细胞接种约5×104个，待细胞铺满板底约60%时弃原培养基，PBS冲洗孔板2次，分组并更换含受试物的培养基，再培养细胞48 h。按细胞周期检测试剂盒标准操作流程，消化收集并固定细胞，染色后上BD流式细胞仪检测。实验独立重复3次。

3.4Annexin V/PI双染法检测SW-13细胞凋亡 取处于对数生长期SW-13细胞接种于6孔板(每孔5×104细胞)，待细胞铺满板底约60%时弃原培养基，PBS冲洗孔板2次，分别换相应受试物培养基培养细胞48 h。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室温下避光染色15min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

3.5划痕愈合实验检测细胞迁移能力 将24孔板背面横向画线，每孔3条。对数生长期细胞消化并均匀接种于孔板内，培养细胞密度为细胞间无空隙。用直尺比划，以100 μL枪头沿直尺固定，垂直于孔板背后画线，对孔板细胞笔直划痕。用PBS沿孔板边轻冲洗细胞3次，吸去划下的细胞，对照组加入无血清L-15培养基，药物组分别加入无血清含有4、8和16 μmol/L药物的培养基。放入上述培养条件培养，分别于18 h和36 h在相差显微镜下选定同一位置拍照，计算细胞迁移率。

3.6Transwell实验检测细胞侵袭能力 将对数生长期细胞撤血清饥饿培养过夜。消化细胞、离心，并分别用无血清培养基及含4、8和16 μmol/L阿昔替尼药物的无血清培养基重悬细胞。调整细胞浓度至1×108/L。分别取细胞悬液200 μL加入Transwell小室，小室下孔板内加入500 μL含30%FBS的培养基。细胞培养36 h后，弃去培养液，将Transwell小室取出，用棉签擦去小室内侧细胞及基质胶，无水甲醛固定小室外侧细胞20 min，再用0.1%结晶紫溶液染色15min，PBS冲洗小室内外侧3次。在倒置相差显微镜，计数5个随机视野的细胞数量。

3.7Western blot检测相关蛋白表达 收集阿昔替尼处理48 h的SW-13细胞至离心管中，充分裂解细胞，利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，进行12%SDS-PAGE分离，使用半干转膜法将蛋白转移至硝酸纤维膜上，脱脂乳室温封闭1 h，加人 I 抗兔抗人β-actin抗体、兔抗人VEGFR2 抗体、兔抗人p-ERK 1/2抗体及兔抗人ERK1/2 抗体，置于4℃摇床过夜孵育。用TBST洗涤5次，每次5 min，加入II抗(HRP标记山羊抗兔IgG)，室温孵育1h，ECL发光试剂显色，利用化学发光型凝胶成像系统检测目的条带，内参照采用β-actin，利用ImageJ软件进行灰度分析。

4 统计学处理

各组实验独立重复3次。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。细胞活力和划痕愈合实验结果采用两因素方差分析(two-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni检验；细胞周期、细胞侵袭实验、细胞凋亡率和Western blot结果分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CCK-8法检测阿昔替尼对SW-13细胞生长的抑制作用

以0 μmol/L阿昔替尼作为对照组，结果显示，同一时点，随阿昔替尼浓度增加，细胞存活率明显降低(P<0.05)；同一药物浓度，随作用时间延长，细胞存活率也显著降低(P<0.01)，见图1，即阿昔替尼抑制SW-13细胞增殖呈浓度-时间相关性。计算出阿昔替尼作用24 h、48 h和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(19.06±1.09) μmol/L、(6.49±0.03) μmol/L和(4.13±0.04) μmol/L。

Figure 1.The effect of axitinib on the viablility of SW-13 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;##P<0.01vs24 h group.

图1 阿昔替尼对SW-13细胞活力的影响

2 阿昔替尼阻滞SW-13细胞周期

流式细胞术结果显示，与对照组相比，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼组S期无明显变化，处于G0/G1期细胞的比例减少(P<0.01)，而G2/M细胞的比例明显升高(P<0.01)，见图2。表明阿昔替尼对细胞周期有抑制作用，可将SW-13阻滞在G2/M期。

3 阿昔替尼促进SW-13细胞凋亡

Annexin V/PI双染色流式细胞检测结果显示，对照组细胞凋亡率为(3.50±0.42)%，1 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼组细胞凋亡率分别为(3.80±0.60)%、(9.80±1.08)%和(17.90±2.17)%。与对照组比较，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，见图3。

4 阿昔替尼减弱SW-13细胞迁移能力

对照组在18 h和36 h后，细胞已明显向划痕区迁移并覆盖划痕空白条带，而阿昔替尼干预后，能够显著抑制 SW-13细胞向划痕区的迁移。Two-way ANOVA分析，除4 μmol/L组在18 h迁移率与对照组相比差异无统计学显著性外，其余各阿昔替尼组迁移率和对照组相比均显著降低(P<0.01)，见图4。提示阿昔替尼可减弱SW-13细胞迁移能力，且阿昔替尼抑制细胞弱迁移的能力和其作用时间和药物浓度呈正比关系。

Figure 2.The effect of axitinib on the cell cycle distribution of SW-13 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图2 阿昔替尼对SW-13细胞周期的影响

Figure 3.Axitinib induced apoptosis in the SW-13 cells. The SW-13 cells treated with Axitinib were stained with annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图3 阿昔替尼对SW-13细胞凋亡的影响

Figure 4. The effect of axitinib on migration ability of SW-13 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图4 划痕愈合实验检测阿昔替尼对细胞迁移能力的影响

5 阿昔替尼抑制SW-13细胞侵袭能力

Transwell小室外侧的SW-13细胞数量，8和16 μmol/L阿昔替尼组较对照组明显减少(P<0.01)，见图5。结果表明阿昔替尼可以抑制SW-13细胞对组织基质的侵袭能力。

6 阿昔替尼抑制VEGFR2介导的ERK1/2磷酸化

Western blot结果示,与对照组相比，阿昔替尼呈剂量依赖性地抑制VEGFR2的表达；p-ERK1/2在用药后的蛋白水平明显降低(P<0.01)，而ERK1/2的表达无明显差异,见图6。提示阿昔替尼抑制前列腺癌细胞的活力和迁移可能与调控VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平相关。

Figure 5.The effect of axitinib on the invasion ability of SW-13 cells(×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图5 阿昔替尼对细胞侵袭能力的影响

Figure 6.The effects of axitinib on the protein levels of VEGFR2 and p-ERK1/2 in SW-13 cells was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图6 阿昔替尼对SW-13细胞VEGFR2和p-ERK1/2蛋白表达水平的影响

讨 论

肾上腺皮质癌是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤。据研究报道ACC年发病率为0.02%[1-3]。ACC起病隐匿，肾上腺皮质癌组织形态在影像学上和正常肾上腺组织相似，影像学诊断困难。有功能ACC肿瘤其临床表现与肾上腺良性肿瘤表现相似，容易误诊漏诊；而无功能型ACC更难以被发觉；多数ACC患者被诊断时已有远处转移。失去手术机会的ACC患者，需要使用化疗、放疗、肿瘤栓塞等姑息治疗方法，然而这些治疗效果都不理想。即使是早期ACC患者施行根治性切除术，也需要术后服用药物来防止肿瘤复发[7]。

米托坦作为FDA唯一批准使用的ACC治疗药物，其有效率仅为35%[4]，且米托坦并不能使ACC患者远期生存率显著提高。寻找耐受好、疗效佳的治疗ACC的药物已成为人们关注的焦点。近年来酪氨酸酶抑制剂相关靶向药物，如VEGFR抑制剂等，成为了抗肿瘤靶点研究热点，但VEGFR是否也可能是ACC理想的治疗靶点，目前文献很少。阿昔替尼作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，其主要作用的受体为VEGFR、PDGFR和c-KIT，可通过酪氨酸激酶受体抑制作用，阻断受体型酪氨酸激酶相关信号通路，使肿瘤细胞失去继续分裂和生长的能力[5-6]。Kroiss等[8]在157例肾上腺皮质癌和9例正常肾上腺组织样品中利用免疫组织化学检测了VEGF和VEGFR的表达发现，VEGFR2在ACC组织中表达量较正常肾上腺组织显著增高，同时发现舒尼替尼可以抑制ACC细胞系的增殖，并通过下调HSD3B2表达来抑制肾上腺皮质癌细胞皮质醇的分泌。文献报道索拉菲尼(sorafenib)，另一种TKI，可通过有效抑制VEGFR1、VEGFR2和PDGFR，显著抑制肾上腺皮质癌细胞的生长，表明其在肾上腺皮质癌细胞中具有抗血管生成和抗肿瘤作用[9]，以上研究表明酪氨酸酶抑制剂类可能通过抑制VEGFR，继而抑制肿瘤增殖及血管生成，达到治疗ACC的目的。本研究中，我们通过CCK-8法来检测阿昔替尼对SW-13细胞活力的抑制作用。结果表明，随着药物浓度的升高或药物作用时间的增长，SW-13细胞存活率降低，药物抑制SW-13细胞活力呈浓度和时间双重依赖性。值得注意到的是，阿昔替尼24 h的半抑制浓度(IC50)为19.06 μmol/L，在24 h～48 h期间IC50有显著下降，而48 h和72 h的IC50较为稳定，分别为6.491μmol/L和4.125μmol/L，推测可能由于24 h时细胞尚处于第一个分裂周期，此后细胞分裂受到抑制，故48 h后的IC50变小，即很低浓度的药物即可抑制细胞的活力。可以推测，阿昔替尼对肿瘤细胞的作用主要是通过抑制其生长，而可能并不主要是通过杀伤细胞导致的。以上推测在分析细胞周期和细胞凋亡的实验中得到了进一步的证实。本研究中流式细胞术检测结果显示，阿昔替尼可剂量依赖地将SW-13细胞阻滞于G2/M期，使得细胞不能进入M期，导致分裂指数下降，细胞增殖被抑制；而G2/M期阻滞可能也是DNA的修复期，损伤的DNA在染色体分离前可能得到修复，而不能修复者则退出增殖周期，进入凋亡途径[10]。本研究结果，阿昔替尼用药48 h后，SW-13细胞的凋亡率明显升高，也证明了这一点。但其促凋亡作用似没有周期阻滞作用明显，是否阿昔替尼在抑制SW-13细胞活力的过程中，相对促进其细胞凋亡而言，药物对细胞周期生长的阻滞更加重要，还尚需进一步证明。

恶性肿瘤除了增殖、细胞周期和细胞凋亡等基本生长繁殖特征外，其生物学特征还包括转移特性。本研究划痕愈合实验显示，阿昔替尼可减弱SW-13细胞迁移能力，并且随作用时间延长或药物浓度增高，减弱迁移能力的效果越明显。Transwell实验也证实阿昔替尼抑制了SW-13细胞的侵袭能力。这两个实验互相佐证，证明了阿昔替尼可以降低SW-13细胞的迁移、侵袭能力，这是抗肿瘤转移的重要药物特征。

如前所述，酪氨酸激酶抑制剂是ACC治疗的潜在重要靶点。其中VEGFR相关通路可能通过影响肿瘤增殖、血管生成等达到治疗肿瘤的目的。VEGF配体通过结合到VEGFR2上，催化ATP上的磷酸基转移到Ras蛋白酪氨酸残基上，激活Ras，然后进一步激活PARK级联反应：Raf1→MEK1/2→ERK1/2[11]。MAPK/ERK信号通路，不仅在细胞增殖、细胞凋亡、迁移等过程中起到重要作用，也处于血管生成信号通路的调节中心，决定肿瘤血管生成的最终状态[12]。ERK分为ERK1和ERK2，主要通过磷酸化而激活为有活性的p-ERK1/2，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和血管形成过程，并在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。Sun等[12]研究表明，一种抗血管生成化合物EPOX可以通过抑制ERK磷酸化，从而具有抗肿瘤血管形成的作用。本实验Western blot结果显示，阿昔替尼减少了VEGFR2和p-ERK1/2的蛋白水平。可以推测，阿昔替尼下调VEGFR2表达，导致级联反应Raf1→MEK1/2→ERK1/2抑制，从而抑制ERK的磷酸化这一机制可能与阿昔替尼体外抑制SW-13细胞活力有关。