四川部分地区犬圆环病毒的病原检测及基因组特征

2019-05-21李明翔

中国预防兽医学报 2019年3期

严楠，冯帆，李明翔，汤承，岳华

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

犬圆环病毒(Canine Circovirus, CanineCV)是无囊膜的环状单链DNA 病毒，于2012年首次在美国发现[1]。随后的研究表明，该病毒可以引起犬急性腹泻、呕吐等症状[2-3]。作为一种新型圆环病毒，CanineCV 对犬科动物的危害受到越来越多的关注[4-5]。CanineCV 不仅存在于犬的肠道内，还在其肝脏、脾脏和淋巴组织中被检测到，表明该病毒可能与宿主免疫抑制有关[2]，其致病机制可能与猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus，PCV-2)相似[6-7]。最近的研究显示，CanineCV常与犬细小病毒2型(Canine parvovirus，CPV-2)、犬冠状病毒(Canine Coronavirus，CCoV)和犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV）共感染，在肠道疾病中起协同作用从而导致临床症状加重[6]；或者在其它病原体损伤宿主肠道上皮细胞和淋巴细胞后，CanineCV 的致病性发生变化，从而加重病情[7]。由于CanineCV 还没有合适的细胞培养体系，其确切的致病性仍不清楚。目前，Gen-Bank 中所有完整的CanineCV 基因组大小均为2 063 nt，具有3 个开放阅读框(ORF)，其中ORF1 编码病毒复制酶蛋白(Rep)，ORF2编码衣壳蛋白(Cap)，ORF3编码的蛋白功能尚不清楚[1,3-4]。

该病毒目前已在美国、意大利、泰国和德国等地区流行[1,3,5,8]，但国内关于该病毒的研究报告较少。2016年孙文超等从广西地区20份犬血清样本中检测出 1份CanineCV 阳性并获得其基因组，随后建立了 CanineCV 荧光定量 PCR 检测方法[9-10]；汪伟等进行了CanineCV Rep 蛋白的原核表达及CanineCV ORF3 基因的克隆及表达载体的构建[4,11]；但CanineCV 在国内的流行状况仍不清楚，还未见到对犬腹泻样本进行CanineCV 调查的报道。本研究采用荧光定量PCR 方法检测四川部分地区犬腹泻样本的CanineCV，丰富该病原在国内的流行病学资料；采用PCR 方法扩增出6 个完整的CanineCV Rep 基因序列以及1 株CanineCV 四川流行株的完整基因组，有助于了解CanineCV 国内流行株的遗传多样性。

1 材料与方法

1.1 犬腹泻样品 208份宠物犬腹泻粪便样品于2015年～2017年采集自四川省6 家宠物医院，其中141份来自成都市 4 家宠物医院(2015年39份、2016年62份和 2017年40份)，32份来自西昌市 1家宠物医院(2015年10份、2016年12份和 2017年10份)，35份来自遂宁市 1 家宠物医院(2015年12份、2016年13份和 2017年10份)。取适量粪便样品与PBS 缓冲液，按照1∶10 的比例稀释涡旋振荡5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min。离心后取上清液置于EP 管中，储存在-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂胶回收提取试剂盒、核酸提取试剂盒购自OMEGA BIO-TEK公司。DNA Marker Ⅱ 、TRIzolTM、Prime ScriptTM反转录试剂盒、pMD19-T 载体试剂盒均购自 TaKaRa 公司。E.coliDH5α 购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 犬腹泻粪便样本的检测采用核酸提取试剂盒提取 208份犬粪便样本的 DNA，根据 Hsu[8]建立的CanineCV 的荧光定量 PCR 方法对 208份粪便样本DNA 进行检测。按照TRIzol 试剂盒说明书提取CanineCV 阳性粪便样本 RNA，反转录成 cDNA，于-20 ℃保存备用。随后对CanineCV 阳性样本参照文献[12]分别检测 CPV-2、CCoV 和 CDV，以调查该样品混合感染情况。

1.4 CanineCV 完整Rep 基因的扩增及序列分析参考文献[9]中的引物(Rep-F：5'-GTATTACCCGG CACCTCGTC-3' 和 Rep-R：5'-CGGAGCGAGAGGCC TTTATC-3')扩增Rep 全基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以提取的CanineCV阳性样本 DNA 为模板，采用 25 μL 反应体系，反应条件为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 55 s、56 ℃ 50 s、72 ℃1 min，共 40 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化后克隆至pMD19-T 载体，筛选阳性重组质粒，重组菌液由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。测序后将所获得序列与GenBank 中的相似序列应用MegAlign(DNAStar 7.0)软件进行同源性分析，并采用MEGA 7 软件 ClustalW 法进行序列比对，利用Neighbor-Joining 法建立系统发育树进行遗传进化分析，重复次数为1000。

1.5 CanineCV 四川株(CD17/2016)全基因组扩增及分析设计3 对扩增上述获得的CanineCV 四川株(CD17/2016)的全基因组的引物，其中1 对引物参照文献 [9](Rep-F：5'-GTATTACCCGGCACCTCGTC-3'/Rep-R：5'-CGGAGCGAGAGGCCTTTATC-3')，另外两对引物参照GenBank 中登录的CanineCV 序列(KC241984 和 KT734814)设计(CanineCV-P2F：5'-TA TCGGCGGCTCAGTATCAT-3'/CanineCV-P2R：5'-CA GACACTTCTACATCCCAAATC-3'；CanineCV-P3F：5'-TCGTGACACTGAATGGCGTTTG-3'/Canine CVP3R：5'-GAGGTGTGCTGTGTCTGTGACGAGG-3')。以CD17/2016 的 DNA 为模板，利用3 对引物分别扩增，PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序后利用SeqMan (DNAStar 7.0)软件拼接序列。将获得的CanineCV 全基因组序列利用BLAST 软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)与参考序列比较分析。

1.6 统计分析统计分析不同年份CanineCV 的阳性率，采用SPSS16.0 统计软件进行数据分析，检验方法为 χ2检验。

2 结果与讨论

2.1 CanineCV 的阳性率及与其它病原共感染的情况采用PCR 方法检测四川部分地区CanineCV 的感染情况，结果显示，208份犬腹泻粪便样品中共检出32 个 CanineCV 阳性样本，平均阳性率为 15.4%；成都市的平均阳性率为16.3 % (23/141)；西昌市的平均阳性率为12.5 % (4/32)；遂宁市的平均阳性率为14.3 % (5/35)。32份 CanineCV阳性样品中，25份与 CPV-2 混合感染，18份与 CCoV 混合感染，14份与CDV 混合感染。对不同年份的CanineCV 阳性率统计与分析，结果显示，3年间CanineCV 的阳性率无显著差异(p＞0.05) (表1)。本研究首次对国内腹泻犬粪便样本进行了CanineCV 的调查，结果表明CanineCV 已经在四川部分地区腹泻宠物犬中流行，并且与 CPV-2、CCoV 和 CDV 混感率很高，这与对美国和台湾地区的犬腹泻粪便中CanineCV 感染的调查结果相似[2,8]。已经证实，CanineCV 与 CPV-2等重要肠道病毒的混合感染会加重患病犬的临床表现并使得治疗更加困难[6-7]。目前国内对于犬腹泻病原的诊断常限于 CPV-2、CCoV 和 CDV 等常见病原，本研究结果建议把CanineCV 作为犬腹泻病原诊断的一个检测内容。

2.2 CanineCV Rep 基因序列分析利用引物Rep-F/Rep-R 从 6份阳性样品中扩增出了 984 bp 的目的片段，克隆后测序获得了 6 株 CanineCV(CDX2/2017、CDX8/2017、CQS2/2016、CQS8/2016、CQM7/2016 和 CD17/2016) 完整的 Rep 基因序列(MG266900～MG266904 和 MG266899)，序列长度均为 912 bp，编码303aa。基于核苷酸序列同源性分析显示6 株Rep 序列同源性为99.6 %～99.9 %，与GenBank 中参考株的Rep 基因序列同源性为82.5 %～97.6 %。遗传进化分析显示，本研究获得的6 条Rep 基因序列与部分意大利、德国和美国病毒株聚在一个大分支，但聚为一个独特的亚支(图1)，本研究6 条 Rep 基因序列与GenBank 中的其它 CanineCV Rep 序列相比有4 个相同核苷酸的同义替换(51T、195T、234T、345C)。Rep 蛋白为 CanineCV 基因组中最大的 ORF1 所编码，主要参与病毒的复制[11]。为进一步研究中国CanineCV Rep 基因的分子特征，本研究获得了6 条完整的CanineCV Rep 基因序列。结果显示中国CanineCV 株的Rep 基因具有遗传多样性，而四川部分地区的 CanineCV 株的 Rep 基因具有4 个相同核苷酸的同义替换，表现出共进化的趋势。尽管CanineCV Rep 中同义替换的意义还不清楚，但在鸭圆环病毒和类圆环病毒中，Rep 序列中的同义替换时有发生，可能是进化过程中的中性选择压力所导致的[13-14]。

表1 犬腹泻粪便样品CanineCV 阳性率及混合感染结果Table 1 Analysis of the CanineCV positive samples

2.3 CanineCV 基因组序列分析利用引物Rep-F/Rep-R、CanineCV-P2F/CanineCV-P2R 和 Canine CV-P3F/CanineCV-P3R 从1份阳性样品中扩增出了984 bp、391 bp 和 970 bp 的目的片段，测序后拼接获得了的CanineCV CD17/2016 株的完整基因组序列(MG266899)。基因组长度为 2 063 bp，共 3 个ORF，其 ORF1 编码病毒复制酶蛋白 Rep (303aa)；ORF2 编码病毒衣壳蛋白 Cap (270aa)；ORF3 全长519 bp，编码 172aa。CD17/2016 的基因组有两个位于起始密码子和终止密码子之间的基因间隔区(长度为 203 bp 和 135 bp)。相比于其它 CanineCV 株，包括本研究中获得的另外5 条Rep 基因序列，CD17/2016 株的Rep 基因中共有10 个核苷酸的非同义替换，导致Rep 蛋白具有7 个独特的氨基酸变化(255H、256F、257Y、258T、279R、297S、299T)，所有的变化均集中在Rep 蛋白aa255～aa299 之间，位于 Rep 的 3' 端。目前关于 CanineCV Rep 基因各区域的功能尚不清楚，但来自PCV-2 的研究表明，Rep 3' 端区域的氨基酸变化可以导致PCV-2 的致病性改变[15]。因此，有必要进一步研究 CanineCV CD17/2016 株Rep 3' 端区域氨基酸变化的生物学意义。

本研究首次对国内犬腹泻样本进行CanineCV感染的调查，结果显示CanineCV 已经在四川部分地区的宠物犬中流行，因此建议把CanineCV 作为犬腹泻病原诊断的一个检测内容。本研究获得了1株 CanineCV 四川株的全基因组，与国内登录在GenBank 的另外两个基因组(KT946839.1 和MF797786.1)遗传距离关系较远，有助于了解 CanineCV 国内流行株的遗传多样性。