王昌建，彭 志*，王卫国，唐小明，鲁杏华，林 源，邓国华，何世成

(1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410014；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 / 农业部动物流感重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)

H10 亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是危害公共卫生安全的潜在隐患，不仅能够感染家禽和野鸟，还能够感染海豹与野生犬类等多种哺乳动物[1-3]，某些欧亚分支与北美分支的H10 亚型AIV 对雪貂呈现出一定的致病性[4]。1949年，德国首次在鸡体内分离出 H10 亚型流感病毒[5]，此后H10 亚型AIV 在陆生家禽和水生鸟类中的分离频率越来越高。目前感染人的H10 亚型AIV 包括H10N7与H10N8 亚型，分别在埃及、澳大利亚和中国有报道，感染患者均与家禽有过密切接触史[6-8]，而全球范围内暂未有H10 亚型AIV 持续人传人的报道。

活禽交易市场中AIV 基因突变和重组频繁，对AIV 的传播和进化起着非常关键的作用，本实验在湖南省主要活禽市场的禽流感(AI)持续监测中，从健康的鸭体内分离出一株H10N1 亚型AIV，对其进行全基因组测序和遗传演化分析，以及对小鼠的感染性试验，为我国H10 亚型AIV 的综合防控提供相应的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病毒株与实验动物 本研究所用H10N1 亚型AIV A/duck/Hunan/S10078/2015 (H10N1)，简 称 为HuN/78/15，由国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存；10日龄SPF 鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 H1～H16 亚型AIV 血清购自哈尔滨维科公司；病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购自Invitrogen公司；DNA 聚合酶和 DL2000 DNA Marker 购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒购自 OMEGA 公司；DNA 测序试剂盒购自Applied Biosystem 公司。

1.3 病毒的增殖及鸡胚半数感染量(EID50)的测定将 HuN/78/15 经 10 倍倍比稀释后接种于 10日龄SPF 鸡胚，在 37 ℃孵育 48 h，4 ℃过夜，收获鸡胚尿囊液，利用血凝抑制试验(HI)检测无其它亚型病毒混合后，继续下次纯化，共纯化3 代后进行病毒扩增；增殖后的病毒10 倍倍比稀释后经鸡胚尿囊腔接种5枚 10日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养 48 h 后收集尿囊液测定血凝价(HA)，根据 Reed-Muench 法计算 EID50。

1.4 分离病毒全基因组测序与遗传演化分析 按照病毒RNA 提取试剂盒说明书提取传代纯化后的HuN/78/15 的病毒RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录成 cDNA，参照 Hoffmann[9]等的引物，PCR扩增病毒的 8 个基因节段，回收产物纯化，利用ABI 公司的测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1进行病毒的全基因序列测定。序列经过DNAStar 软件拼接后，利用 MegAlign 进行同源性比对，利用MEGA5.0 软件绘制HA 基因进化树。

1.5 病毒对BALB/c 小鼠的感染试验 将8 只6 周龄BALB/c 小鼠轻度麻醉后，每只小鼠通过鼻腔接种 50 μL 106EID50的病毒稀释液，另设 5 只 BALB/c小鼠接种等体积PBS 作为对照组。感染组接种后3 d随机迫杀3 只小鼠，按顺序采集脑、鼻甲、脾脏、肾脏、肺脏进行病毒滴定，其余5 只小鼠与对照组小鼠连续观察14 d，记录每天的体质量变化情况。

2 结果与讨论

2.1 HA基因的测序及演化分析 病毒株HuN/78/15的基因测序结果显示，其 HA 基因全长 1 683 bp，编码561 个氨基酸，裂解位点为 IIQER↓GLFG，仅含一个碱性氨基酸，为低致病性禽流感病毒(LPAIV)的分子特征。HA 基因含有7 个潜在糖基化位点，分别为29NGT31、45NAT47、52NTS54、252NIT254、306NLS308、422NWT424、494NNT496；参照 H3 亚型 AIV 的HA 基因比对后，病毒株 HuN/78/15 的 HA 基因第226 位与第228 位分别为谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有结合禽源受体的分子特征；遗传演化分析结果显示，HuN/78/15 的HA 基因位于欧亚分支，与其同源性最高的病毒株为越南分离株A/duck/Vietnam/OIE-0483/2012(H10N7)，同源性为 97 %(表1)，推测其HA 基因可能与该病毒有相同的进化来源，将HuN/78/15 的 HA 基因与 2013年江西省人感染的H10N8 病毒 A/Jiangxi-Donghu/346/2013 (H10N8)，以及 2013年江西家禽感染的 H10N8 病毒 A/duck/Jiangxi/6648/2013(H10N8)的 HA 基 因进 行比对 ，同源性分别为84.3%与85.1%，亲缘关系较远(图1)。

2.2 NA 基因与内部基因的测序及演化分析 测序结果显示病毒株HuN/78/15 的NA 基因全长为1 410 bp，编码470 个氨基酸，存在7 个潜在的糖基化位点，分别为50NQS52、58NNT60、63NQT65、68NIS70、88NSS90、146NGT148、235NGS237，不存在茎部缺失情况。遗传演化分析结果显示，HuN/78/15 的NA 基因位于欧亚分支，与其同源性最高的病毒株为越南分离株A/teal/VietNam/MBP5/2006(H5N1)，同源性为 94 %；内部基因来源复杂，其中PB2 与PB1 基因与H7N9、PA 与 NP 基因与 H4N6、M 基因与 H3N2、NS 基因与H11N7 亚型AIV 分别具有最高的核苷酸同源性(表1)，表明 HuN/78/15 的内部基因可能与多个亚型的AIV 发生了基因交换。

2.3 HuN/78/15 对BALB/c 小鼠的感染试验结果病毒分离株 HuN/78/15 以106EID50的剂量鼻腔接种小鼠后，感染组小鼠在观察期未表现出明显的临床症状，在感染后的1 d～6 d 出现体质量的轻微下降，最大下降8 %，感染第7 d 开始体质量逐步回升(图2)，在迫杀的感染小鼠的鼻甲和肺脏中能够检测到病毒的复制，病毒滴度分别为5.17 log10 EID50与 5.67 log10 EID50，其它脏器中未检测到病毒(图3)，表明分离株 HuN/78/15 对小鼠呈低致病性。

图1 HuN/78/15 株的HA 基因进化树Fig.1 Phyogentic tree based on HA gene of HuN/78/15

表1 病毒株HuN/78/15 各基因节段最高同源性病毒株Table 1 The highest homologous strain of each gene segment of HuN/78/15

图2 小鼠感染病毒后的体重变化情况Fig.2 Weight change of mice after inoculated with virus

图3 人工感染3 d 后小鼠脏器病毒滴定结果Fig.3 Virus titration in mice organs at 3 days post artificial infection

本实验研究结果表明，分离株HuN/78/15 的裂解位点处仅有一个碱性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征，其 HA 基因 226(Q)与 228(G)位点，PB2 基因627(E)与 701(D)位点[10]，表明 HuN/78/15 倾向结合禽源受体。小鼠在感染 HuN/78/15 后体质量呈一过性的轻微下降，病毒也仅在感染小鼠的肺脏和鼻甲中复制，表明该病毒株对小鼠呈低致病性，与上述的LPAIA 子特征相一致。El-Shesheny 等在最近的研究中指出 H10N1 亚型AIV 不需要提前适应就能够在小鼠的肺脏、鼻甲、心脏、肝脏等组织有效复制，与本实验结果较为一致，其后续的实验研究显示，H10N1 虽然仅表现出对 α-2，3 受体的结合能力，但在A549 细胞中却有较好的复制能力，表明H10N1 亚型AIV 仍有感染人的风险[11]。

H10 亚型AIV 偶尔感染家禽，带毒家禽一般呈隐性感染不发病[12-13]，研究表明禽源 H10N8 亚型AIV 与H7N9、H9N2 等亚型基因重组后能够提高病毒结合哺乳动物 α-2，6 受体的结合能力[6,14]，本实验中分离株 HuN/78/15 的HA 基因与 2013年人感染的H10N8 的HA 基因亲缘关系较远，但其它基因与H5、H7、H3 等多种亚型的 AIV 的相应基因同源性非常高，因此不排除其造成流行的可能。

在对我国南方地区的AIV 持续监测中发现，家鸭中 LPAIV 分离率比较高，往往多种 LPAIV 存在混合感染的情况，本实验分离株 HuN/78/15 的内部基因与多种亚型LPAIV 的同源性较高，可能与多病毒混合感染有关。本实验对 HuN/78/15 的遗传演化分析显示，分离株的HA、NA 和NS 基因与越南、日本等一些周边国家的鸭源分离株有相似的进化来源，野鸟的迁徙活动对病毒的传播可能起到了一定的作用。