尹曼曼，楼觉人

(上海海利生物技术股份有限公司/上海市兽用生物制品工程技术中心，上海 奉贤 201403)

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗称“ 兔瘟”，是由 RHD 病毒(RHDV)引起的一种急性、败血性传染病，对养兔业造成重大危害，死亡率高达90 %以上[1]。1984年该病首次在中国发现，之后在世界范围内迅速蔓延[2]。

至今仍未有一种能够使RHDV 长期稳定传代的细胞[3]，因此目前用于预防和控制RHD 疫情的疫苗主要是组织灭活疫苗，该疫苗不仅成本高，且一旦强毒灭活不彻底，会进一步传播病毒[4]。RHDV 只有一个血清型，其核衣壳仅由一个60 ku 的主要结构蛋白VP60组成，各分离株VP60 基因高度保守，其核苷酸和氨基酸同源性均在90 %以上，VP60 在病毒诊断和疫苗设计方面发挥着重要的作用[5]。因此科研工作者相继开展对RHDV 基因工程苗的研制，相继在大肠杆菌、杆状病毒、痘病毒、酵母以及家蚕中表达了VP60 蛋白，表达的VP60 可以形成与天然RHDV 病毒粒子在物理形态上类似的不含病毒核酸的病毒样颗粒(VLP)，其能够诱导产生保护性免疫应答[5-8]。2017年2月江苏省农业科学院兔病学科团队研发的RHDV 杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)获得国家新兽药一类注册证书，这是我国也是世界上第一个获得政府许可的针对兔瘟的亚单位疫苗[9]。严维巍等在毕赤酵母GS115 中表达了与天然 RHDV 结构相似的 VLPs，表达的重组蛋白可以凝集人“ O”型红细胞，该血凝性可以被抗RHDV 的高免血清所抑制[9]。但未验证毕赤酵母表达的VLP 对RHDV 的攻毒保护效果。

本研究利用毕赤酵母表达系统构建稳定高效表达的 VP60 重组菌，在酵母内表达 RHDV VLPs，形成的VLPs 结构更稳定和均一，表达量更高，并研究了其对实验兔的免疫保护性，为RHDV 亚单位疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 RHD组织灭活疫苗购自某生物科技有限公司；攻毒用RHDV 为无菌采集的NB强毒株感染致死的SPF 兔肝脏和脾脏研磨所得的肝脾组织毒(LD50为106.0/mL)，由中国农科院上海兽医研究所刘光清研究员惠赠。5 周龄SPF 实验兔，购自山东青岛康大生物科技有限公司。

表达载体pPIC3.5K 质粒和毕赤酵母KM71 菌株购自Invitrogen 公司；分子克隆所需各种酶和试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；RHDV 抗体ELISA 检测试剂盒购自KernelTM公司；小鼠抗VP60单克隆抗体(MAb)购自山东绿都生物有限公司；山羊抗小鼠HRP-IgG 购自金斯瑞生物科技有限公司；Micro BCA Protein Assay Kit 购自上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化物酶DAB 显色试剂盒、葡萄糖、D- 生物素购自生工生物工程(上海)股份有限公司。配置 MD 和 MM 平板以及 BMGY 和 BMMY 培养基所用的YNB 无氨基酵母氮源购自美国BD 公司；市售组织灭活疫苗购自南京天邦生物科技有限公司。

1.2 重组表达质粒pPIC3.5K-VP60 的构建与鉴定RHDV 的 VP60 蛋白氨基酸序列相对保守，按照毕赤酵母密码子偏好表保证其氨基酸序列不变的前提下对VP60 基因序列进行密码子优化，并在其两端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，得到具有自主专利的一条DNA 序列，由金唯智生物科技有限公司合成该DNA。合成的 VP60 DNA 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后克隆至经相同酶切的pPIC3.5K 载体中构建重组质粒 pPIC3.5K-VP60，经BamH Ⅰ/EcoRⅠ双酶切鉴定正确的质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

1.3 重组菌pPIC3.5K-VP60/KM71 的筛选 将pPIC3.5K-VP60 质粒经SalⅠ线性化后电转化KM71菌株，转化后均匀涂布到MD年板上，倒置于28 ℃培养箱中培养3 d，挑取单克隆以供筛选。同时将MD 板上的阳性克隆点样在MM 平板，进一步纯化阳性克隆转化子，经SalⅠ单酶切的pPIC3.5K 空质粒按照同样方法电转入KM71 作为对照。

1.4 重组VP60 蛋白的诱导表达及鉴定 将筛选和纯化后的阳性酵母菌接种至BMGY 中，28 ℃，250 r/min 培养至 OD600nm=2～6，1 500 r/min 离心 5 min 收集酵母细胞并重悬至BMMY 中继续培养诱导目的蛋白的表达，每24 h 补加甲醇至终浓度为0.5 %。诱导48 h 后，离心收集酵母细胞并用PBS 重悬、破碎酵母菌体，上清用于 SDS-PAGE 分析，转化pPIC3.5K 空载体的菌株经同样处理后作为对照。转膜后分别用小鼠抗 VP60 MAb 体(1∶1 000)为一抗，山羊抗小鼠 HRP-IgG (1∶2 000)为二抗，westen blot检测VP60 蛋白的表达。

1.5 重组VP60 蛋白的纯化及电镜观察 取适量诱导后离心收集的酵母菌体，破菌后上清液按终浓度5 %加入 PEG6000，搅拌均匀后4 ℃过夜沉淀后弃上清，充分复溶沉淀后再次以 12 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，上清经 SDS- PAGE 检测并利用透射电镜观察是否形成了VLP。

1.6 VLP 疫苗的制备 纯化后的 RHDV VLP 经BCA 法检测总浓度，SDS-PAGE 后通过灰度分析计算目的蛋白浓度，调整目的蛋白浓度为30 μg/mL、10 μg/mL，按 9∶1 加入 MONTANIDE GEL 01 PR 佐剂常温搅拌10 min 配制成疫苗。

1.7 免疫和攻毒保护试验 将20 只35日龄健康实验兔，随机分成 4组，每组 5 只，1、2 和 3组分别用 30 μg/mL VLP 疫苗、10 μg/mL VLP 疫苗、市售组织灭活疫苗经皮下注射接种实验兔，1 mL/ 只。第4组为对照组，经相同方式和剂量注射相同佐剂乳化的PBS。

免疫后 21 d 采血，采 用 RHDV 抗体 ELISA 试剂盒检测实验兔血清中抗体水平，并用RHDV NB株肝脾组织毒(LD50为 106.0/mL)以1mL/ 只经实验兔颈背部皮下两点注射病毒液，连续观察14 d，记录每组实验兔死亡情况并计算保护率；并在攻毒后14 d迫杀实验兔，观察各组实验兔各脏器眼观病变。

1.8 抗体消长规律检测 另选用15 只35日龄健康实验兔，除无 10 μg/mL 剂量组以外，分组和免疫方式同 1.7，于免疫后的 0、2 周～24 周采血，分离血清，采用ELISA 试剂盒检测实验兔血清中RHDV 抗体的消长规律。

2 结 果

2.1 重组质粒pPIC3.5K-VP60 的构建与鉴定 优化后合成的VP60 DNA 序克隆至pPIC3.5K 载体构建重组质粒pPIC3.5K-VP60。重组质粒经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切得到约9 000 bp 和1 800 bp 的两条片段，与预期相符；该质粒测序结果经Clustal W2 序列比对，结果和优化过的VP60 DNA 序列完全一致。表明正确构建重组质粒pPIC3.5K-VP60。

2.2 目的蛋白的诱导表达及western blot 分析 将pPIC3.5K-VP60 质粒电转化 KM71，经甲醇诱导后，离心收集的酵母细胞破菌液上清用于SDS-PAGE 和western blot分析。SDS-PAGE结果显示：重组菌pPIC3.5K-VP60/KM71 经甲醇诱导后，在 60 ku 左右出现目的条带，而空载体转化菌pPIC3.5K/KM71 无此条带(图1A)；用小鼠抗 VP60 MAb 经 western blot验证显示：重组菌 pPIC3.5K-VP60/KM71 在 60 ku 左右出现特异性条带，而 pPIC3.5K/KM71 无此条带(图1B)。表明，重组菌 pPIC3.5K-VP60/KM71 经培养和甲醇诱导后能够在酵母细胞内表达VP60 蛋白。

图1 RHDV VP60 蛋白表达的SDS-PAGE 检测(A)和western blot 鉴定(B)Fig.1 Detection and identification of the RHDV VP60 expression in Pichia pastoris by SDS-PAGE (A) and western blot (B)

2.3 VP60 蛋白的纯化以及电镜观察 将表达的重组VP60蛋白经PEG6000沉淀纯化，SDS-PAGE 检测结果显示纯化后去除了大部分的杂蛋白，灰度扫描分析其纯度达80 %以上(图2)。检测后蛋白浓度为 650 μg/mL。

将纯化后蛋白样品经负染后在电镜下观察可见大小为30 nm～40 nm 球形颗粒，pPIC3.5K/KM71 酵母菌经相同处理后未观察到类似颗粒(图3)，表明在毕赤酵母中表达的RHDV VP60 蛋白能够组装成VLPs。

图2 纯化后的RHDV VP60 重组蛋白的SDS-PAGE 检测Fig.2 Detection of the purified RHDV recombinant VP60 by SDS-PAGE

图3 电镜观察RHDV 形成的VLPsFig.3 The observation of the VLPs under transmission electron microscopy

2.4 动物免疫和攻毒保护试验结果 将纯化的RHDV VLP 加入佐剂制备为疫苗后免疫实验兔，免疫21 d 时的血清抗体检测结果显示，所有疫苗免疫组实验兔抗体均阳转(OD450nm＞0.3 为阳性)，VLP 疫苗免疫组兔产生的抗体平均水平高于市售的组织灭活苗(图4)。且 30 μg/mL VLP 疫苗免疫实验兔产生的抗体平均水平最高。

疫苗免疫实验兔21 d 时用RHDV 肝脾组织毒攻击所有实验兔。结果显示，PBS 对照组实验兔于攻毒后约20 h 开始发病，表现出RHD 典型的临床症状，如体温升高，精神不振和神经症状等，48 h 内5 只兔全部死亡。而疫苗免疫实验组攻毒后个别兔有一过性的食欲不振和体温升高，攻毒后14 d 内15 只实验兔全部健活，迫杀存活实验兔显示其各个脏器无眼观的病理变化，3组实验兔均获得100 %保护(表1)。结果表明以 10 μg/mL VLP 免疫实验兔后即可和市售组织苗一样，能够100 %保护实验兔抵御RHDV 强毒的攻击。但本实验未发表的数据显示10 μg VLP 免疫实验兔后于第三个月抗体开始下降，并低于市售疫苗组，为了达到可靠的免疫保护期，抗体消长规律试验中兔的免疫剂量仍为30 μg/头份。

图4 免疫不同剂量VLP 疫苗后21 d 实验兔血清中的抗体水平Fig.4 The serum antibody titers in rabbits immunized with different doses of VLPs vaccine at 21 days

表1 RHDV VLP 疫苗的攻毒保护试验结果Table 1 The protection of the rabbits immunized with the VLPs against RHDV challenging

2.5 实验兔免疫后的抗体消长规律检测结果 采用30 μg/mL VLP 疫苗和市售疫苗分别免疫实验兔，免疫后于不同时间点采血检测两组实验兔血清抗体平均效价。结果显示：从免疫后第2 周开始，所有免疫兔抗体阳转，VLP 疫苗和市售疫苗实验兔血清抗体分别在免疫后第1 个月和第2 个月时达到最高，第4 个月两组实验兔抗体水平普遍开始下降，但第6 个月抗体仍维持在一定水平，均高于免疫后21 d时能够提供攻毒保护作用的最低抗体水平(表1，OD450nm=0.618 即可提供攻毒保护)，并且 VLP 疫苗免疫兔后产生的抗体水平整体高于市售疫苗(图5)。表明VLP 疫苗具有较好的免疫原性，且至少能够对实验兔提供6 个月的完全保护。

图5 VLP 免疫兔后的抗体消长规律检测结果Fig.5 The average serum antibody titer at different time post immunized with the VLPs

3 讨 论

VLP 不含有核酸，不存在扩散强毒的危险，生物安全性高，其由一种或几种抗原蛋白的多个单体组装而成，可以高密度地呈现类似于天然病毒的抗原表位，因此相对于其它亚单位疫苗，低剂量的VLP 即可诱导细胞毒性T 细胞和Th 细胞的产生，高效诱导体液免疫和细胞免疫反应[10]。因此，VLP已经成为一项被广泛接受的用于人类开发安全、高效疫苗的技术，还可以用来作为运载工具开发嵌合疫苗和治疗性疫苗，Braeden 等通过在RHDV VP60插入小鼠拓扑异构酶IIα 和生存素的表位，构建了嵌合多价的VLP，在小鼠的结直肠癌模型中均表现出了良好的效果[11]。另外，许多应用酵母系统表达的VLP 开发的疫苗，如 HPV-VLP 疫苗已经成功上市[12]。

巴斯德毕赤酵母表达系统是80年代开发的一种异源蛋白真核表达系统，其具有稳定性好、表达效率高、容易规模化、成本低廉及糖基化等翻译后修饰功能的特点，比杆状病毒或哺乳动物组织培养等真核表达系统更快捷、廉价、表达水平更高[12]。因此本研究选择毕赤酵母表达系统表达目的蛋白。

毕赤酵母表达系统对密码子的偏爱性明显，对外源基因进行密码子优化是决定其表达量的重要因素。对酵母使用密码子的统计分析显示在61 个密码子中有25 个密码子是酵母所偏爱的[13]。本研究根据该偏好性对野生型VP60 基因进行了密码子的优化，较大的提高了其表达量。经蛋白灰度分析显示蛋白表达量可达 200 μg/mL～250 μg/mL。

在酵母细胞胞内环境下自主形成的RHDV VLPs大小和形状均一、稳定，配置成疫苗免疫实验兔后，鉴于传统的人“ O”型红细胞的血凝抑制试验测RHDV 抗体的方法存在主观性强、重复性差和人血红细胞获取不易等缺点[14]，本研究利用针对VP60蛋白的ELISA 试剂盒代替血凝的方法检测实验兔的血清抗体效价，结果显示RHDV VLP 免疫实验兔后可以刺激机体产生至少持续6 个月的高水平的抗体，攻毒试验显示该VLP 疫苗可以保护实验兔免受RHDV 的攻击，保护率达到 100 %。结果表明 VLP具有很好的免疫原性，本研究为开发兔出血症VLP疫苗提供了新的思路和手段。