杨 源，王 军，唐 沙，岳 筠，周 怡，文 明，周碧君，程振涛*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

Toll 样受体作为识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)的 一种模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRRs)[1]，在识别内源性或外源性配体后，募集细胞中的包括髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)、激 活蛋白 1(Active protein-1，AP-1)和核转录因子κB(Nuclear factor of κB，NF-κB)等接头分子，通过系列的信号级联效应，将信号沿着MyD88 依赖性或TRIF 途径传导[2]，启动机体的固有免疫系统和获得性免疫系统，最终调控 IL-1、IL-6、TNF、IFN 等炎性因子和趋化因子的转录，帮助机体抵御和清除病原体[3-4]。近年来，越来越多的研究阐明了Toll 样受体介导了多种疾病的发生，包括人支原体肺炎、哮喘、禽流感等呼吸系统疾病[5-7]；II 型糖尿病等营养代谢性疾病和猪的支原体肺炎等动物疫病[8]。但关于羊疫病与Toll 样受体关系的研究相对较少，本研究建立羊Toll 样受体MyD88 依赖信号传导途径中的重要接头分子MyD88、TRAF6、NF-κB、AP-1基因TaqMan探针荧光定量PCR (qPCR)方法，同时将其应用于检测贵州省境内的5 种羊健康状态下肺组织中各接头分子基因的含量，为探究羊呼吸系统疫病的发生与Toll样受体关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 山羊肺组织样本的采集 健康贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊5 种羊的肺组织各5份，分别采集自贵州省境内地方品种羊饲养区规模养殖场。

1.2 主要试剂 RNA 提取试剂RNAiso Plus (TRI-zol)、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、反转录试剂One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物的设计与合成 参照GenBank 中登录的MyD88、TRAF6、NF-κB、AP-1 基因序列设计特异性引物和TaqMan 探针，探针发光基团为 6-FAM，淬灭基团为BHQ1，引物与探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物探针信息列表Table 1 The information of primers and probes

1.4 各目的基因重组质粒标准品的构建与鉴定 采用TRIzol 法提取羊肺组织总RNA，并反转录成cDNA 后 ，以表1中的引物，通过PCR方法扩增MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因，并将目的基因经胶回收纯化后克隆至pMD18-T 载体，采用质粒PCR 和序列分析的方法鉴定各目的基因质粒。阳性重组质粒应用微量核酸蛋白检测仪进行浓度检测，按照公式：拷贝数(拷贝 /μL)=[6.02×1023×测定质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660×碱基数)]计算各质粒标准品的拷贝数后，作为各基因的质粒标准品。

1.5TaqMan 探针qPCR 方法的优化 按照Premix ExTaqTM(probe qPCR)试剂盒说明书建立 20 μL 反应体系。分别对qPCR 方法初始体系的退火温度(54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃)和引物、探针浓度(0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L、1.2 μmol/L)进行优化，以最小 Ct 值、最强荧光强度和最佳试剂消耗配置确定最优体系。

1.6 标准曲线建立 将各质粒标准品从1×109拷贝/μL 10 倍倍比稀释至 1×100拷贝 /μL。各取 7 个浓度的质粒标准品，按优化好的体系，进行qPCR 扩增，根据扩增的Ct 值和相对应的浓度关系，绘制各基因扩增的标准曲线。

1.7 特异性试验 应用建立的各目的基因的Taq-Man探针qPCR方法分别对含 MyD88、AP-1、NF-кB、TRAF6 基因质粒标准品的混合物进行扩增，以评价所建方法的特异性。

1.8 敏感性试验 以最佳反应体系，对浓度为1×109拷贝 /μL～1×100拷贝 /μL 的含 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因的质粒标准品分别进行 qPCR 扩增，分析所建方法的敏感性。

1.9 重复性试验组内重复：取每个目的基因3 个已知浓度质粒为模板，每个浓度设3 个重复，在同一个反应程序下进行qPCR 扩增，计算每个浓度下3 个重复Ct 值的变异系数。组间重复：取每个目的基因3 个已知浓度的质粒为模板，每个浓度设3 个重复，分别在不同时间进行qPCR 扩增，计算每次试验Ct 值的变异系数，以评估该方法的重复性。

1.10 不同品种羊肺组织样本目的基因的检测与分析 对采集自贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊共5 种羊的等量肺组织样本(每种羊 5份)，按 TRIzol 法提取每份样品的总 RNA，反转录为cDNA后，分别进行MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 的 qPCR 扩增，并应用已建立的标准曲线计算相应分子的转录水平，每份样本重复3次，浓度计算结果采用SPSS 软件分析。

2 结 果

2.1 各目的基因重组质粒标准品的鉴定 应用各目的基因的特异性引物，以羊肺组织cDNA 为模板，进行PCR 扩增，结果显示：扩增分别得到了约为137 bp、151 bp、161 bp 和 151 bp 的目的条带，分别与 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因片段大小相符(图略)。将各基因片段克隆至 pMD18-T 载体，构建含4 个目的基因的质粒标准品，采用质粒PCR和序列分析方法鉴定各重组质粒，结果显示，重组质粒经PCR 能够扩增出各目的基因的特异性条带(图1)，测序结果经 NCBI 比对正确。表明正确构建了含各目的基因的重组质粒标准品。

图1 MyD88 通路分子基因质粒PCR 鉴定结果Fig.1 Identification of the plasmids of MyD88 pathway linkers by PCR

2.2 目的基因qPCR 的优化结果 对检测MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1基因的qPCR方法进行条件优化，最终优化结果见表2。

表2 检测各基因的qPCR 体系优化结果Table 2 The optimization of the qPCR conditions for target gene detection

2.3 各目的基因标准曲线的建立 将含MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 4 个基因的重组质粒在 1×109拷贝 /μL～1×103拷贝 /μL 共 7 个浓度进行 qPCR 扩增，绘制的各基因扩增曲线以及标准曲线结果显示，各基因浓度与 Ct 值均有较好的线性关系(图2～图5)，且相关系数 R2分别为 1、1、1 和 0.998。扩增效率 E 分别为 97.24 %、98.03 %、93.08 %和1.01 %，均在 90 %～105 %。表明建立的 4 种基因的qPCR 方法具有较好的扩增效率。

2.4 qPCR 特异性试验结果 以含MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因质粒标准品混合物为模板，根据各基因的最佳PCR 体系，分别进行qPCR 特异性检测。扩增结果显示，每个qPCR 检测体系均扩增出单一曲线(图6)。表明本研究建立的各基因的qPCR方法具有较高特异性，彼此之间不存在相互影响。

图2 羊MyD88 基因qPCR 扩增曲线和标准曲线Fig.2 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep MyD88 gene

图3 羊TRAF6 基因qPCR 扩增曲线和标准曲线Fig.3 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep TRAF6 gene

图4 羊NF-кB 基因qPCR 扩增曲线和标准曲线Fig.4 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep NF-кB gene

2.5 qPCR 敏感性试验结果 以浓度为1×109拷贝/μL～1×100拷贝 /μL 的含 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因的质粒标准品为模板进行qPCR 的敏感性试验。结果显示，该方法对上述各质粒最小检出量分别为 1×101拷贝 /μL、1×102拷贝 /μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝 /μL (图7)。表明本研究建立的检测各目的基因的qPCR 方法具有较高的敏感性。

图5 羊AP-1 基因qPCR 扩增曲线和标准曲线Fig.5 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep AP-1 gene

图6 各目的基因qPCR 方法特异性试验结果Fig.6 Specific test of the established qPCR method

图7 各目的基因qPCR 方法的敏感性试验结果Fig.7 Sensitivity tests of the established qPCR methods

2.6 qPCR 重复性检测结果 分别以含MyD88、TRAF6、NF-кB 和 AP-1 基因重组质粒为模板，对建立的各基因qPCR 方法进行组内重复和组间重复试验。结果显示，不同浓度各质粒标准品的组内和组间变异系数均小于5 % (表3)，表明所建立的方法具有较好重复性和稳定性。

表3 羊Toll 样受体MyD88 信号通路接头分子qPCR 方法重复性试验结果Table 3 Repetitive evaluation of the qPCR methods for the Toll-like receptor MyD88 signaling pathway linkers in goats

2.7 不同品种羊Toll 样受体MyD88 信号通路接头分子定量检测与分析结果 将建立的方法应用于不同品种羊肺组织中基因转录水平的检测，结果显示，NF-кB 在 0.1g 贵州黑山羊肺组织中含量为2.64×106拷贝 /μL，极显著高于其它品种羊(p＜0.01)，且其它品种羊之间该基因含量差异不显著(p＞0.05)；MyD88 在 0.1g 黔北麻羊肺组织中含量为 4.95×105拷贝 /μL，极显著高于其它品种羊(p＜0.01)，其余几种羊之间该基因的含量差异不显著(p＜0.05)；AP-1在 0.1g 麻羊肺组织中含量为 3.5×104拷贝 /μL，极显著高于湖羊、黑山羊和白山羊(p＜0.01)；TRAF6在 0.1g 黑山羊肺组织中含量为 4.2×105拷贝 /μL，显著高于麻羊、白山羊和波尔山羊(p＜0.05)，极显著高于湖羊(p＜0.01) (图8)。表明 4 个基因在不同品种羊肺组织之间存在差异，这种差异性可能与不同品种羊对疫病的易感性差异有关。

图8 羊Toll 样受体MyD88 信号通路基因在不同品种羊肺组织中的定量结果Fig.8 Quantitative results of the same genes in different breeds of sheep lung tissues

3 讨 论

qPCR 技术被广泛应用于基因的定量检测中，主要有染料法和探针法两种，其中探针法具有较高的特异性。李世芳等通过qPCR 的方法，阐明了epsilon 干扰素的转录水平在口蹄疫病毒感染后不同时间段内并无变化，进一步阐明了I 型干扰素的不同亚型在其抗病毒感染过程中的作用[9]；孙文超等采用qPCR 技术，对山羊痘病毒N1 蛋白缺失株感染山羊外周血淋巴细胞后，TLR2 和TLR9 基因转录水平的检测，结果证明了TLR2 和TLR9 在抗病毒感染过程中的作用[10]。Xue 等通过qPCR 技术证明了绵羊肺炎支原体感染羊支气管上皮细胞后，TLR2/TLR4 基因在 MyD88 传导通路中的重要作用[11]。本研究建立了检测不同品种山羊Toll 样受体MyD88信号传导途径中 MyD88、AP-1、NF-кB、TRAF6 4种接头分子的TaqMan 探针 qPCR 方法，具有较强的特异性、较好的稳定性和重复性；敏感性与多数文献报导一致。本研究在对羊的该4 个功能基因进行特异性检测时，采用了区别于病原微生物特异性检测时以同科异属、同属异种或临床较难区分的疫病的病原核酸为模板，进行qPCR 特异性检测的方法，考虑更多的是在检测4 个基因时，彼此之间是否存在非特异性的扩增，所以采用含4 个基因的混合质粒为模板进行qPCR 扩增，以确定彼此之间是否干扰。结果表明，建立的检测方法特异性强，扩增4 个基因时不存在相互干扰的情况[12-13]。

Toll 样受体在调节机体免疫和抗感染方面具有重要的作用[14]。越来越多的研究表明：Toll 样受体与机体肺部炎症等疾病的发生有密切的联系。方晓敏等研究显示，猪TRL2、TRL4 的变异导致猪对支原体肺炎感染存在明显的差异性[15]。研究显示在TLR1～TLR10 中除了 TLR3 之外，所有 TLRs 信号将会沿着TLRs-MyD88-TRAF6- NF-κB/AP-1途径进行信号传递[16]。对MyD88 信号传导途径的研究，在阐明Toll 样受体介导的病原分子与机体的相互关系方面至关重要。李玲等用中草药麻杏石甘汤灌喂禽流感病毒感染小鼠模型后，定量分析TLR4-MyD88-TRAF6 信号传导途径中，各接头分子转录水平的变化，阐明了该药剂通过抑制MyD88 通路中接头蛋白分子的表达，从而减缓肺部炎症的发生[17]。张子杰等通过对 TLR-MyD88-NF-κB 信号通路接头分子变化的定量分析，阐明了Toll 样受体与肝癌的临床病理分期、血清肿瘤标志物含量密切相关[18]。但是目前，关于羊呼吸系统疾病的发生与Toll 样受体关系的研究相对较少。应用本研究建立的方法对不同品种山羊在健康状态下肺部组织中的MyD88 依赖性途径接头分子转录水平进行定量分析，显示不同品种羊在正常状态下的Toll 样受体MyD88 通路分子MyD88、TRAF6、NF-κB和AP-1转录水平存在差异，这种转录水平的差异是否会与不同品种羊对呼吸系统疫病的易感性存在关系，有待进一步研究。本研究建立的方法为探究山羊呼吸系统疫病的发生与Toll 样受体信号传导的关系奠定基础，并为研究羊Toll 样受体信号传导与动物疫病的发生关系提供参考资料。