王 潇，夏瑶宾*

（1.内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古自治区中医药研究所，内蒙古 呼和浩特 010020）

引 言

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS，以下简称内异症)是一种复杂的疾病，其发病机制不清，病变广泛、形态多样，极具侵袭性和复发性，严重影响妇女的健康和生活质量[1-2]。由于雌激素是子宫内膜异位症病变发展的主要驱动因素，大多数已建立的治疗方法都是以产生一种能暂时缓解的低雌激素状态为目标[3]。目前，大多数用于治疗内异症的西药效果尚可，但具有停药后易复发，且副作用多等弊端。因此，寻求多靶位、多环节抑制异位内膜形成的药物显得尤为重要。

气虚是中医解释内异症发生和发展的立足点。因此，中医临床治疗内异症以活血化瘀为基本，另外辅以益气、温肾和清热等法，整体疗效较好[4]。化瘀消异胶囊（HYXYJN）98年以来用于临床，治疗子宫内膜异位症，对子宫内膜异位症有明显的疗效。本研究分离子宫内膜异位症的离体细胞为模型，研究HYXYJN对子宫内膜细胞增长的影响，探讨其对内异症的影响机理。

1 主要试剂和仪器

胎牛血清，胰蛋白酶，胶原酶Ⅰ、DNAase，雄烯二酮，多聚甲醛，细胞培养板，Triton X-100，鼠抗人波形蛋白（vimentin）抗体，鼠抗人角蛋白（cytokeratin）抗体，FITC标记羊抗小鼠IgG，CCK-8试剂盒，羊抗鼠IRG/PITC；流式细胞仪(BECHMAN)、倒置相差显微镜(ZEISS Observer.A1)、二氧化碳培养箱(Thermo HERACELL 150i)、多功能微孔板读数仪(Thermo VARIOSKAN FLASH)。

2 病例入选标准

2015年5月～2017年12月期间，收集内蒙古自治区人民医院妇科就诊为子宫内膜异位症患者样本，入选标准为：⑴年龄24～48岁；⑵月经规律，周期28～32天；⑶无其它内分泌、免疫或代谢性疾病；⑷手术前三个月内未接受激素治疗。另外，用无菌方法通过刮宫或直接剪切留取子宫内膜收集5例子宫肌瘤患者样本作为对照，其子宫内膜正常同时排除了内异症。非内异症组10例成活4例，内异症组8例成活5例。

3 实验方法

3.1 子宫内膜细胞分离培养

将清洗干净的组织剪碎至糊状，依次加入0.2%胶原酶Ⅰ和20 U/mL的DNA酶进行孵育。然后使用15%胎牛血清的培养液终止消化，以1000 rPm转速离心5 min后，弃上清。重复两次。加入含有15%血清的培养液吹打均匀，接种至培养皿，37℃、5%CO2培养箱中培养。

3.2 细胞免疫荧光染色

室温下，经过多聚甲醛固定，TritonX-100通透和BSA封闭后，按照1:300比例滴加一抗，4eC过夜孵育。次日，弃液体，PBS清洗三次，加入FITC标记羊抗小鼠IgG(1:300)，避光孵育1 h后，DAPI复染5 min，清洗制片。PBS代替一抗孵育细胞作为阴性对照，共聚焦显微镜观察vimentin和cytokeratin的表达情况。

3.3 检测细胞生长曲线

将原代培养的内异症和对照组内膜细胞分别进行消化，以4h103个/孔的密度接种于96孔培养板。培养24 h后，弃去培养液，加入不含血清培养液同步化24 h。分别加入不含有和含有180 μg/ml、18 μg/ml、1.8 μg/ml HYXYJN的培养液200 μl，同时各孔分别加入1h10-7mol/L雄烯二酮进行刺激。0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，检测450 nm处测定OD值。以无细胞的培养液作为空白调整本底，以时间为横轴，光密度值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

4 实验结果

4.1 子宫内膜细胞培养

酶消化后，悬浮细胞呈圆形，折光性强。置于37℃、5%CO2培养箱中培养6小时后开始贴壁。密度均匀。培养4天后，细胞融合度为85%以上，生长良好。

4.2 子宫内膜腺上皮及间质细胞免疫荧光鉴定

以PBS作为一抗进行孵育为阴性对照，角蛋白和波形蛋白染色均为阳性，表明原代培养细胞中同时含有上皮细胞和间质细胞。结果见图1。另外，角蛋白荧光染色强度较波形蛋白染色强度弱，表明间质细胞数量较多，上皮细胞含量较少。分离培养的子宫内膜细胞中大多是间质细胞。

图1 免疫荧光鉴定子宫内膜细胞

4.3 HYXYJN对子宫内膜细胞生长的影响

细胞生长结果见图2所示。各组内异症在位内膜细胞随HYXYJN浓度增加，抑制作用加强。其中，180 μg/ml浓度的HYXYJN培养组抑制作用最强；18 μg/ml和1.8 μg/ml 浓度的HYXYJN培养组仅在96 h时有差异，其余时间点无差异。相同时间下，内异症内膜细胞数量显著高于非内异症内膜细胞（P＜0.05），表明内异症内膜细胞的增殖速度大于非内异症内膜细胞。

5 讨 论

综上结果表明，内异症在位内膜细胞的增殖活性明显高于非内异症内膜细胞；平台期时的细胞数量也明显高于非内异症内膜细胞。这可能与非内异症内膜细胞间的接触抑制效应较强有关，细胞趋于静止状态。然而，内异症在位内膜细胞间接触抑制较弱。因此，其生长较为活跃，具有向肿瘤细胞过渡的趋势，体现出不同于正常内膜的“恶性”行为。整体上，HYXYJN对非内异症和内异症在位内膜细胞的增殖活性没有显著影响，仅在浓度180μg/ml作用72h、96h后对细胞的增殖活力有一定抑制作用，HYXYJN组与桂枝茯胶囊组无显著差异。

图2 HYXYJN对分离培养的子宫内膜细胞生长的影响