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(1.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室,宁夏银川 750021;2.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021;3.宁夏红枸杞产业集团有限公司,宁夏银川 750000)

枸杞属药食两用植物[1],含有丰富的营养成分及生物活性物质[2],具有增强人体免疫力,以及抗衰老、防肿瘤等功效[3-5]。枸杞果酒是以宁夏枸杞果为原料,经酵母菌发酵制成的低度酒,较完整的保留了枸杞的主要营养成分[6]。

目前关于枸杞果酒的研究多集中于营养成分变化和生产工艺方面,有关枸杞果酒风味方面的研究报道较少,且均为商用酵母发酵研究。王琦等[7]采用HS-GC-MS法研究枸杞汁发酵前后香气成分,结果表明发酵后的枸杞汁风味物质的种类和含量较枸杞原汁有所增加。汤卫华等[8]比较了5株活性干酵母和安琪酵母的发酵能力,综合考虑发酵能力和枸杞酒样香气成分含量,最终选出一株酵母作为生产菌种。商用酿酒酵母具有较强的发酵能力,但产生挥发性香气的能力不足[9]。大量研究表明,非酿酒酵母在葡萄酒酿制过程中,通过与酿酒酵母的共同发酵来控制酒体不理想的风味或者降低乙醇含量来赋予葡萄酒复杂的香气,从而增加葡萄酒感官质量特征的复杂性[10-13]。其中葡萄汁有孢汉逊酵母产醋酸能力低,其产醋酸与乙酸乙酯的量与乙醇呈反向相关,可对葡萄酒感官结构具有很好的平衡作用;并且其分泌的糖苷酶具有葡萄酒增香酿造的应用潜力[14]。工业生产上,枸杞发酵前大多需通过清洗去除枸杞果表面大量农药残留,枸杞果表面的非酿酒酵母也损失不少。此外,考虑季节性因素,生产中还常使用干果复水的方法进行发酵。以上因素是造成枸杞果酒果香不突出、典型性欠佳的重要原因。

目前,非酿酒酵母在枸杞果酒酿制过程中的作用尚未见报道。本实验重点研究葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母混种发酵枸杞酒。旨在通过对不同菌种、不同接种时间及不同接种比例探究枸杞果酒风味的变化,探讨葡萄汁有孢汉逊酵母在枸杞酒发酵过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母AC(Saccharomycescerecisiae522 Davis) 法国Laffort公司;葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)GF-60、GF-85 本实验室分离筛选,经ITS间区鉴定,并进行冷冻保藏;枸杞干果 宁夏红枸杞产业集团有限公司。

GCMS-TQ8040三重四极杆型气相色谱质谱联用仪 日本岛津公司;手动固相微萃取(SPME)装置 美国supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞发酵酒的工艺流程及操作要点 本实验按某企业干型枸杞果酒的生产工艺流程(图1)进行操作,具体如下:

图1 枸杞果酒发酵工艺流程Fig.1 The fermentation process of wolfberry wine

操作要点:

干果复水:干枸杞和水按照1∶10的比例进行混合复水。

浸提:将复水好的液体煮沸30 min,冷却后留清汁作为枸杞汁培养基备用。

预处理:30～40 ℃下,添加30 mg/kg果胶酶和50 mg/kg果汁复合酶进行酶解;酶解后的枸杞汁,添加40 mg/kg SO2处理。

调整成分:在枸杞汁中添加柠檬酸至酸度值为3 g/L;同时,为使目标酒精度在8.0%～10.0% Vol之间。在发酵前期和发酵中期分别补加白砂糖100和70 g/L。

酵母活化:将3种酵母菌分别接种于YPD培养基中活化。YPD活化培养基的制备:按1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖,95%蒸馏水配制活化培养基,115 ℃灭菌15 min。混菌发酵:采取清汁发酵的方式,分阶段定量添加葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母,具体参数见1.2.2,发酵温度设为20 ℃。

分离:当比重达0.992～0.996,残糖低于4 g/L时发酵结束,采用虹吸法进行分离。

澄清过滤:抽滤机进行精滤。

理化检测[15]:测定挥发酸、残糖、酒度、总酸、游离SO2、总SO2。

1.2.2 发酵实验 分别进行GF-60与AC,GF-85与AC不同接种比例、不同接种时间的混种发酵,总接种量为6%(v/v)。具体方法为将菌种于YPD液体培养基活化培养后,按体积比接种于枸杞汁中,间隔接种时需先接种GF-60或GF-85,一定时间后再接种AC。具体接种比例及接种时间发酵的酒样编号见表1。同时对AC进行单独发酵,编号为1#,发酵结束后进行感官和香气及味道属性的评定。结合理化指标,选取其中较好的组别进行后续放大实验,并对挥发性成分进行分析。其中,接种实验在200 mL三角瓶中进行,放大实验在2000 mL三角瓶中进行。

表1 酵母菌混种发酵实验设计Table 1 Experimental design of yeast mixed fermentation

1.2.3 感官评价 挑选9名在枸杞酒行业从业5年及以上的专业人员作为评定人员,其中4女5男,年龄在30～40岁之间。实验在宁夏红枸杞产业集团中宁枸杞制品有限公司的标准品酒室完成。品评杯具为透明郁金香酒杯,样品随机放置。品评者分别从色泽、香气、口感及状态方面对样品打分。具体感官评价标准见表2[16]。

表2 枸杞果酒感官评价标准Table 2 Standards of sensory evaluation of wolfberry wines

1.2.4 香气及味道属性分析 对1.2.3中感官评价较好的样品进行针对性的香气及味道属性评价。同样挑选9名在枸杞酒行业从业5年的专业人员作为评定人员,4女5男,年龄在25～40岁之间。采用刘文丽[17]提到的定量描述分析(QDA)法对枸杞酒的5个主要香气特征,即枸杞果香、甜香、生青味、醇香和发酵香;4个味道特征,即苦味、酸味、甜味、涩味进行定量描述分析,以10点制标度为描述标准。

1.2.5 理化指标的测定 对1.3.3中感官评价较好的样品,根据GB/T-15038-2006[15]中描述进行理化指标的测定。具体检测内容有:酒度、挥发酸、总酸、残糖、游离SO2、总SO2。

1.2.6 挥发性成分分析 根据1.3.3及1.3.4结果综合考虑选出较好组别进行枸杞酒挥发性成分的分析。

1.2.6.1 挥发性化合物的萃取 利用手动顶空固相微萃取(HS-SPME)法对枸杞酒样品中挥发性物质进行富集,取20 mL顶空瓶,用无菌移液管加8 mL于40 ℃恒温磁力搅拌器上平衡10 min,插入CAR/DVB/PDMS纤维头40 ℃吸附15 min,GC解吸3 min,用于GC-MS分析。

1.2.6.2 气相色谱质谱工作条件 色谱条件为:色谱柱为RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升温:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,再以8 ℃/min升至220 ℃,保持1 min。载气为He,体积流量为1.40 mL/min,进样口温度为210 ℃。质谱条件为:EI 电离源,电子能量为70 eV,灯丝流量为0.20 mA。检测器电压为350 V。扫描范围为20～450 AMU,离子源温度为200 ℃。

1.3 数据统计分析

本实验数据和图采用Excel 2007进行计算。本实验中检测结果用SPSS 19软件进行统计分析。质谱图利用NIST 02谱库进行检索。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵对产品感官品质的影响

19个样品的感官评价结果见图1。得分最高的样品为11#(94分),即葡萄汁有孢汉逊酵母GF-85与酿酒酵母AC按3∶1的比例同时接种发酵的枸杞酒。该酒体色泽金黄、外观澄清透明,光泽度高;酒香浓郁、香气协调,具有清新的果香、醇香;味道酸甜协调,酒体丰满,后味悠长;枸杞特征明显,典型性突出。得分高于酿酒酵母AC单独发酵的枸杞果酒有七组,分别为2#、5#、9#、10#、11#、14#、18#。

图2 混种发酵枸杞果酒的感官评分Fig.2 The sensory scores of wolfberry wine with mixed fermentation

GF-60和GF-85与AC的比例和接入时间恰当时,所发酵的果酒感官质量优于AC单独发酵的果酒。无论GF-60和GF-85与AC同时接种发酵,还是先接种GF-60或GF-85,间隔3 d后接种AC,样品的感官评分都随GF-60和GF-85接种比例的降低而下降。但先接种GF-60或GF-85,间隔6 d后接种AC,样品感官评分先提高后下降,这可能与GF-60和GF-85的生长特性及其代谢产物对AC生长的影响有关。所有样品在酒体色泽上得分较高(18～20分),都表现出良好的枸杞酒特有的金黄色,酒体透明度高;样品在状态(16～20分)上无混浊及沉淀或有少量沉淀物。差异主要表现在风味和口感上。不同酒样差异较大。其中风味评分,最高分(18分)与最低分(12分)的差距有6分;口感评分,最高分(38分)与最低分(18分)的差距为20分。混菌发酵改变了产品的风味和口感,使不同样品的酒体呈现很大差异。

2.2 不同酵母接种量及不同比例对产品香气及味道属性的影响

选择得分高于1#(即酿酒酵母单独发酵枸杞酒)酒样的七组样品进行进一步香气及味道属性的分析。不同酒样的香气与味道属性平均得分表见表3,并形成相应的雷达图(图3)。

表3 不同比例及不同时间接种发酵的枸杞酒香气与味道属性得分表Table 3 Average scores of wolfberry wines with different inoculation time and ration from sensory analyses

图3 混种发酵对枸杞果酒的香气与味道属性的影响Fig.3 Effects on of aroma and taste properties of wolfberry wine with mixed fermentation

香气属性方面,各样品枸杞果香味不突出,其中1#酿酒酵母单独发酵枸杞果香味得分最低。所有供试样品的生青味较弱,这可能与发酵原料为枸杞干果有关。1#酿酒酵母单独发酵枸杞酒的醇香最强烈,10#枸杞酒的醇香最寡淡。发酵香气在各样品间差异较大,11#得分最高,发酵香气最浓郁,1#酿酒酵母单独发酵枸杞酒得分最低。

味道属性方面,各样品都有着淡淡的后苦味,较弱的涩口感。总体而言,GF-85参与发酵的11#、14#、18#酒样体现出酸甜适口偏酸的特点;而GF-60参与发酵的2#、5#、9#、10#及酒样体现出酸甜适口偏甜的特点。11#和9#酒样圆润丰满,酸甜适中,爽口,后味干净,总体评价较优。14#、2#、18#入口较为纯正,爽口,但醇厚感较弱,总体评价次之。AC单独发酵的1#酒样酒体较其它酒样整体感觉较为单薄,寡淡。

综合结果,最终选择2#、9#、11#、14#、18#进行理化指标和挥发性成分检测,与1#进行比较分析。

2.3 不同酵母接种量及不同比例对基本理化指标的影响

基本理化指标结果见表4。各酒样的残糖含量均在12 g/L以下,符合干型枸杞果酒的要求。酒精度在7.20%～9.30%,其中9#酒精度最高,11#酒精度最低。可见,产品酒精度除与酿酒酵母产酒精能力有关外,非酿酒酵母也在其间发挥着作用。混种发酵样品的最终酒精度与非酿酒酵母菌种、混合比例、接种间隔时间均有关系,其间复杂的规律及机理有待进一步后续研究。

表4 不同枸杞酒样品的理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of wolberry wine samples

滴定酸的含量影响产品味道,挥发酸含量影响产品香气。滴定酸含量在4.42～7.36 g/L,挥发酸含量在0.16～0.86 g/L,符合标准。样品游离SO2含量在19.05～22.86 mg/L,总SO2含量在35.55～45.71 mg/L,符合国家标准。

2.4 挥发性成分分析

枸杞酒中的挥发性物质与枸杞汁本身及酵母发酵产生的代谢物有关。酵母菌不同、接种比例及接种时间的差异都会导致代谢物的差异。不同样品的挥发性物质采用GC-MS分析,获得的总离子流图见图4。所检测到的质谱数据经过NIST标准谱库检索后,获得不同样品挥发性化合物的种类及相对含量见表5。

图4 混种发酵枸杞果酒的GC-MS总离子流图Fig.4 Total ion chromatograms of wolfberry wines with mixed fermentation

由表5可得,6个样品共检测出58种挥发性成分;其中酯类物质32种,醇类物质10种,烷烃类9种,醛类物质1种,酸类物质2种,酮类物质2种,其他化合物2种。

表5 不同枸杞果酒的主要香气成分Table 5 Aromatic composition of different wolfberry wines

续表

酯类物质是构成枸杞果香的主要成分。与先前报道的鲜果生产的枸杞果酒中主要酯类物质不同[7-8],由干果复水发酵的枸杞果酒,无论AC单独发酵还是AC与GF-85或GF-60混种发酵,辛酸乙酯(9.21%～17.22%)与癸酸乙酯(2.33%～1.50%)的相对百分含量较高,是枸杞酒样的主要酯类物质。辛酸乙酯具有白兰地酒香气,癸酸乙酯具有果香和花香的香气[18]。除辛酸乙酯与癸酸乙酯外,与AC单独发酵相比,混种发酵产生了更高的己酸乙酯、3-甲基-乙酸丁酯和9-癸烯酸乙酯,这些物质产生不同的气味[19],赋予了枸杞酒更加丰富的香气。

除酯类物质外,醇类物质也是枸杞酒挥发性成分的重要组成部分。1,3-丁二醇(24.94%～51.49%)和异戊醇(7.97%～13.10%)是醇类中占比最高的成分,此外,还含有少量的2,3-丁二醇。其中异戊醇具有酒香和果香,1,3-丁二醇具有苦甜味,2,3-丁二醇具有黄油奶酪的味道。异戊醇不仅是鲜果生产的枸杞果酒中的重要物质[20],同时也是干果发酵酒样中的重要物质。

烷烃类化合物虽检测到的种类有9种,但其相对含量较低。加之烷烃香味阈值较高,一般被认为对风味物质的直接贡献不大,其也可能是形成杂环化合物的重要中间体,有助于提高酒体的整体风味。

单独发酵与混种发酵样品的挥发性化合物统计分析结果见表6。结果显示,接种了GF-60和GF-85的枸杞果酒酯类物质无论种类还是数量均高于AC单独发酵的酒样,其中18#酒样的酯类物质多达23种,占比42.75%。AC单独发酵的1#酒样的醇类物质种类最多,相对含量最高,这是感官评价时1#酒样的醇香压过酒香的原因。其中高级醇和酯是发酵酒的主要香味和口味物质,能使酒体具有丰满的香味和口味,并增加酒体的协调性。但含量太高会破坏酒体及风味的协调,给酒体带来异香或异杂味[21]。各样品混合发酵的醇类物质种类和占比均低于1#酒样,但感官评价高于1#酒样。原因可能与混合发酵的醇类物质与酯类物质含量恰到好处,使酒体更加协调。

表6 不同枸杞酒样品中挥发性化合物统计结果Table 6 Statistical results of volatile compounds in different wolfberry wine samples

3 结论

本实验研究了葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵对干性枸杞果酒品质的影响。使用酿酒酵母AC与葡萄汁有孢汉逊酵母GF-62或GF-85按不同比例,不同接种间隔时间进行发酵枸杞果酒。感官评价、香气及味道属性分析结果显示接种比例及间隔时间恰当时,混种发酵枸杞果酒与酿酒酵母单独发酵枸杞果酒相比,表现出更佳的感官品质。GC-MS法对挥发性成分分析显示,接种了GF-60和GF-85的枸杞果酒其酯类物质种类和数量均高于AC单独发酵的枸杞果酒,但AC单独发酵的枸杞果酒醇类物质高于混合发酵枸杞果酒。

只要比例合适,接种时间恰当,先接种非酿酒酵母再接种酿酒酵母进行混合发酵,能更好的体现枸杞果酒的典型特征,改善枸杞果酒的品质和风味。本实验的结果为高品质干型枸杞果酒的研发生产提供了有益的借鉴。