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(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039;2.西华大学西华学院,四川成都 610039)

牦牛是我国青藏高原特有的物种,常年生长在海拔3000米以上的高寒地区,抗寒能力强,体质粗壮结实[1]。牦牛肉富含蛋白质(18%～22%),脂肪含量较低(2%～5%),还含有多种必需氨基酸和微量元素,其氨基酸模式有利于人体消化吸收[2]。我国境内的牦牛大约有1300万头,占世界总量的95%以上[3]。虽然我国拥有大量的牦牛资源,但由于地域限制和肉品贮藏手段在各地区发展的不平衡,使得对牦牛肉贮藏技术和贮藏过程中水分变化的相关性研究的报道较少。李儒仁等[4]研究了冻藏对牦牛肉蛋白质、脂质氧化和保水性的影响。马华丽等[5]研究了引起牦牛肉冷藏过程中变质的原因,分析了感官指标、理化指标和微生物指标在牦牛肉冷藏过程中的变化规律。

真空包装技术被广泛用于肉类保鲜,但是,利用真空包装技术保鲜牦牛肉的应用和研究较少。白风奎等[6]对真空包装延长牦牛鲜肉货架期进行研究,通过单因素实验与正交试验得出,温度是影响真空包装牦牛肉货架期的主要因素。低场核磁共振技术(Low Field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)是近年发展起来的一种快速、有效、无损的水分检测技术[7]。利用低场核磁共振技术,通过横向驰豫时间可检测肉中水分子的移动和分布状态,驰豫时间越长,表示水与大分子物质之间的作用力越小[8]。国内外许多学者利用低场核磁共振技术研究了鸡肉[9]、猪肉[10]、鳕鱼肌肉[11]等肉类的T2弛豫时间,可有效地反应水分变化与肉品品质变化之间的关系。

目前,应用低场核磁技术研究真空包装的牦牛肉品质变化较少。本研究利用低场核磁共振技术监测真空包装牦牛肉在4 ℃冷藏条件下的水分变化,并将水分及含量变化与肉品品质指标进行Pearson相关性分析,提供一种利用LF-NMR技术对冷藏牦牛肉进行科学、无损的品质监测方法,为肉品品质变化的机理研究及科学合理贮藏牦牛肉提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牦牛肉 当地农贸市场;氧化镁、三氯乙酸、氯仿、乙二胺四乙酸(EDTA)、碘化钾、磷酸盐、硫酸铜、氢氧化钠等 均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂;牛血清白蛋白(BSA) BR(生物试剂),上海如吉生物科技发展有限公司;2-硫代巴比妥酸(TBA) 纯度≥98.5%,上海科丰实业有限公司。

MesoMR23-040V-1型低场核磁共振仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司;K9840型自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;SW-CJ-1FD型无菌工作台 苏净安泰有限公司;Molecular Devices SpectraMax i3x型酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司;DHP-9052型恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;XINGHE真空包装机 诸城市兴和机械有限公司;DK-98-Ⅱ型水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;TD-5M型离心机 四川蜀科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛肉预处理 将新鲜牦牛肉剔除筋腱和脂肪,切分为5 cm×5 cm×2 cm,约50 g左右,利用真空包装袋将牛肉包装后抽真空放置于4 ℃冰箱中贮藏。在贮藏的第0、3、6、9、12、15、18 d天测定样品的蛋白质溶解度、挥发性盐基氮、微生物菌落总数、硫代巴比妥酸值(TBARS)、T2横向弛豫时间和蒸煮损失。

1.2.2 菌落总数的测定 参考GB4789.2-2016[12]的方法测定菌落总数。

1.2.3 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 参照GB5009.228-2016[13]的方法,运用自动凯氏定氮仪法测定牦牛肉中TVB-N的含量。

1.2.4 硫代巴比妥酸值的测定 参照Marianne等[14]的方法。与TBA反应的物质的量(TBARS)测量结果以每100 g肉中丙二醛的mg数来表示。

TBARS(mg/100 g)=(A532-A600)/155×(1/10)×72.6×100

式中:A532:532 nm处所测的紫外吸光光度值;A600:600 nm处所测的紫外吸光光度值。

1.2.5 蛋白质溶解度的测定 参照牛力[15]的方法,取1 g样品切碎,加入pH=7.2的20 mL碘化钾(1.1 mol/L)和磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L)的混合液,用漩涡震荡仪震荡均匀,于4 ℃冰箱中冷藏20 h。然后进行离心,离心力2600×g,时间30 min,室温。离心后取上清液1 mL,加入双缩脲试剂A(0.1 g/mL的氢氧化钠溶液)3 mL,旋涡振荡后再加入双缩脲试剂B(0.01 g/mL的硫酸铜溶液)2滴,在37 ℃水浴锅中加热20 min。吸取200 μL样液于96孔板中,用酶标仪测得540 nm波长时肉样的吸光值。

标准曲线的制作:利用牛血清蛋白作对照,分别取浓度为2 mg/mL的牛血清蛋白0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL(牛血清蛋白质量为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg)。向每只试管中加入蒸馏水至1 mL,加入双缩脲试剂量和操作方法同上。以牛血清蛋白质浓度作为横坐标,以吸光度Abs的值为纵坐标绘制标准曲线,得到方程y=0.0366x+0.0002,R2=0.9998。

1.2.6 蒸煮损失的测定 取10 g牦牛肉切成小块,放于蒸煮袋中,在95 ℃的电热恒温水浴锅内加热10 min,当肉的中心温度达到85 ℃时,取出样品,冷却至常温,用滤纸擦干表面水分,然后称量,以未处理的样品为对照。蒸煮损失按下式计算:

蒸煮损失(%)=[(蒸煮前肉重-蒸煮后肉重)/蒸煮前肉重]×100

1.2.7 自旋-自旋弛豫时间(T2)的测定 准确称取样品3 g,用滤纸擦拭干净样品表面水分,置于核磁样品管中,而后放入磁体腔内,进行核磁共振测定样品中水分含量,不同贮藏时间的肉样测定4个平行。首先在Q-FID序列下利用标准水膜进行仪器的校正,采用90°和180°脉冲进行校正,然后放入样品,寻找样品的最佳TW、NS参数值,最后选择Q-CPMG序列进行样品的弛豫时间采集。测试条件:氢质子共振频率23 MHz,测定温度(32±0.02) ℃,选择Q-CPMG序列,采样频率(SW)=100 kHz,回波数(NECH)=3000,回波时间(TE)=1.00 ms,重复次数(NS)=2,等待时间(TW)=3700 ms,90 °脉宽(P1)=10.00 us,180°脉宽(P2)=20.00 us,采样点数(TD)=150028,O1=940152.75,NMR测得的图为自由诱导指数衰减曲线,通过仪器自带的反演软件进行数据反演,得到样品中不同组分水分的弛豫时间与峰面积,最后对实验结果进行分析处理[16]。

1.3 数据处理

试验数据用SPSS 22.0处理并进行Dunacans差异显著性分析和Pearson相关性分析,用Origin 8.6进行绘图处理。

2 结果与分析

2.1 菌落总数的变化

由图1可见,随着冷藏时间的延长,牦牛肉中的菌落总数不断增长。在前6 d微生物生长处于延滞期,因此增长相对比较缓慢,从第9 d开始进入对数期,至第18 d增长迅速,且第15 d已达到7.15lg cfu/g。鲜肉腐败主要受肉表面微生物的生长和繁殖的影响,微生物的生长和繁殖会引起肉感官品质及理化品质的下降,从而缩短鲜肉的货架期[17-19]。经过真空包装的牦牛肉可以有效地隔绝肉与外界环境的接触,减少氧气含量,抑制需氧型微生物的生长繁殖,延长肉的货架期。但是由于牦牛在宰杀后,在分割、储运及销售过程中极易受到微生物污染,导致牦牛肉表面的初始微生物数量增加。因此牦牛肉从市场运回实验室,再经过真空包装,于4 ℃冷藏条件下贮藏,腐败在很大程度上取决于肉品初期所带初始腐败菌的数量。

图1 贮藏时间对牦牛肉中菌落总数的影响Fig.1 Effect of storage time on the total number of colonies in vacuum-packaged yak beef

2.2 挥发性盐基氮(TVB-N)的变化

由图2可见,牦牛肉中TVB-N的含量随贮藏时间的延长而增大,这是由贮藏过程中微生物的繁殖和生长分解蛋白质产生氨及胺类物质而引起的,直接影响其新鲜度[20]。TVB-N在第12 d含量达到13.67 mg/100 g,第15 d时已达到21.37 mg/100 g,超过了国家标准GB2707-2016[21]“鲜(冻)畜、禽产品”卫生标准规定(鲜肉的TVB-N≤15 mg/100 g)。

图2 贮藏时间对牦牛肉中TVB-N含量的影响Fig.2 Effect of storage time on TVB-N contents in vacuum-packaged yak beef

2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS)的变化

由图3可见,随着贮藏时间的延长,TBARS值不断增加,当贮藏到第15 d时,比初始值增加了0.103 mg/100 g。说明随着贮藏时间的延长,牦牛肉中的脂肪发生氧化酸败的程度增加。肉中脂肪发生氧化酸败的原因可能是由于游离脂肪酸在冷藏过程中发生氧化生成醛、酮、酸等小分子物质,因此TBARS值呈增长趋势[22]。真空包装的牦牛肉中的脂肪在贮藏期间,受包装袋内残留的氧气、微生物和酶等因素的影响,脂肪会发生氧化反应,从而引起牦牛肉品质的不断下降。同时肌肉中蛋白质的碱性基团以及碳水化合物中的游离糖类都能够加快氧化速率[23];除此之外,肌肉中的血红蛋白和肌红蛋白的降解产物原卟啉、血红素同样具有加快脂肪氧化速率的作用[24]。因此随着冷藏时间的增长,肉品的氧化程度不断加深,得到的TBARS值也就相应增大。

图3 贮藏时间对牦牛肉中TBARS含量的影响Fig.3 Effect of storage time on TBARS contents in vacuum-packaged yak beef

2.4 蛋白质溶解度的变化

蛋白质溶解度的降低是肉品质下降的重要指标,因为肉中蛋白质的加工特性和食用品质只有在蛋白质处于高溶解状态下才能表现出来。从图4可以看出,随着冷藏时间的延长,蛋白质溶解度不断地减小,当贮藏到第18 d时,比初始值降低了50.92%。这是由于牦牛肉贮藏过程中,蛋白质的水合环境发生变化,破坏了维持蛋白质结构的作用力平衡,并且因为一些基团的水化层被破坏,基团间的相互作用引起蛋白质的聚集或亚基重排,造成蛋白质的变性,溶解度不断地减小[25-26]。

图4 贮藏时间对牦牛肉中蛋白质溶解度的影响Fig.4 Effect of storage time on protein solubility in vacuum-packaged yak beef

2.5 蒸煮损失的变化

牦牛肉蒸煮损失的变化如图5所示,0～3 d牦牛肉蒸煮损失迅速增加,3～12 d出现下降趋势,12 d以后又出现小幅度上升,推测其原因可能是贮藏前期牦牛肉本身的自由水含量高,这部分水很容易损失。贮藏中期,由于自由水随着时间的延长不断渗出,因此蒸煮损出现下降趋势。到贮藏后期由于微生物的作用和肌肉内各种酶的降解作用,导致蛋白质网状结构的大量解体,肌肉持水力下降,造成蒸煮损失的再次上升[27]。

图5 贮藏时间对牦牛肉蒸煮损失的影响Fig.5 Effect of storage time on cooking loss of vacuum-packaged yak beef

2.6 水分及含量的变化

2.6.1 不同贮藏时间横向弛豫时间T2的变化 图6显示的是经过真空包装的牦牛肉在贮藏过程中的NMR横向弛豫时间T2的反演图谱。从图6中可以看出,肉样在进行NMR反演后的弛豫图一共有4个峰,区间分别处于T21、T22(1～10 ms)、T23(10～100 ms)和T24(100～1000 ms)。四个峰的分界明显,弛豫时间和峰面积各不相同,这可以反映肉中水分存在的三种状态,其中T21、T22(0～10 ms)表征结合水,与蛋白质等有机大分子紧密结合,作用力强,通常存在于肌纤维内部,即使受肌肉蛋白质结构变化、电荷变化、外力变化的影响,也不能改变其与蛋白质结合的状态,所以结合水对肌肉系水力影响很小[28]。T23(10～100 ms)表征不易流动水,存在于肌纤丝、肌原纤维及细胞膜之间的不易流动水占肉中水分含量的80%左右,在0 ℃以下结冰,且易受外力、蛋白质结构变化等的影响,通常情况下肌肉的系水力主要由这部分水决定[29]。T24(100～1000 ms)表征的是存在于细胞间隙和结构组织中的自由水。自由水是由物理吸附作用与肉结合,因此这部分水在贮藏过程中很容易流失[30]。由图6可以看出,随着贮藏时间的延长,T21、T22弛豫时间后移,但T21、T22峰面积总和减小的幅度较小。弛豫时间的变化说明在贮藏过程中结合水与大分子物质之间作用力的强弱发生改变。T23、T24峰面积不断减少,说明不易流动水和自由水随着贮藏时间的延长不断减少。

图6 牦牛肉在贮藏过程中横向弛豫时间分布Fig.6 Transverse relaxation time distribution of yak beef during different storage times

2.6.2 不同贮藏时间牦牛肉水分相对含量的变化 根据T2区间的积分面积可以估算氢质子的相对含量。因此,可以用T21,T22,T23,T24峰积分面积来表示牦牛肉贮藏过程中水分含量的变化情况,即T21,T22,T23,T24质子密度。不同时间贮藏下牦牛肉T2质子密度变化见表1。T21,T22在整个贮藏过程中呈下降趋势,说明结合水的相对含量随着贮藏时间的延长有减小的趋势。T23在整个贮藏过程中不断减小,在第3 d以后减小幅度增大(p<0.05),这是由于不易流动水不断地转变为自由水,从而不断渗出,因此,T23质子密度显著下降(p<0.05)。同时可以看出,T24在贮藏过程中不断减小,到第12 d以后几乎检测不到T24的信号。自由水是由物理吸附作用与肉结合,因此这部分水在贮藏过程中很容易流失[16]。

表1 不同贮藏时间牦牛肉T21、T22、T23、T24质子密度变化Table 1 Change of T21,T22,T23,T24density of yak beef at different storage times

2.7 各指标的相关性分析

将真空包装4 ℃贮藏条件下牦牛肉弛豫特性与品质指标进行相关性分析,结果如表1所示。由表1不同品质指标间的相关性可知,贮藏时间与TVB-N、菌落总数之间呈现极显著正相关(p<0.01),与TBARS显著正相关(p<0.05),与蛋白质溶解度、T23、T24极显著负相关(p<0.01),表明肉的品质指标与贮藏时间之间有着显著相关性。T21与菌落总数、TVB-N显著负相关(p<0.05),与蛋白质溶解度显著正相关(p<0.05);T22与T24显著正相关(p<0.05)。从相关性分析可以看出T21、T22与其他指标间相关性不大,因为随着贮藏时间的延长,T21、T22变化不显著(p>0.05)。菌落总数与T23、T24、蛋白质溶解度呈极显著负相关(p<0.01),与TVB-N、贮藏时间呈极显著正相关(p<0.01),与TBARS显著正相关(p<0.05)。从相关性分析可以看出,肉中的不易流动水和自由水在贮藏过程中都能被微生物利用,随着微生物的生长繁殖,肉中的蛋白质被分解利用,产生氨及胺类物质从而引起的TVB-N值的增加。TVB-N与TBARS、贮藏时间、菌落总数呈现极显著正相关性(p<0.01),与蛋白质溶解度、T23之间则呈现极显著负相关(p<0.01),与T24显著负相关(p<0.05)。

表2 各指标间的相关性分析Table 2 Correlation analysis between various indicators

TBARS与贮藏时间、菌落总数、TVB-N之间均呈现出显著或极显著正相关(p<0.05或p<0.01),与蛋白质溶解度显著负相关(p<0.05)、与T23极显著负相关(p<0.01)。蛋白质溶解度与贮藏时间、菌落总数、TVB-N极显著负相关(p<0.01),与TBARS显著负相关(p<0.05),与T23、T24极显著正相关(p<0.01)。在肉的贮藏过程中,氧化反应也在缓慢发生中,研究表明,肉中脂质的氧化与蛋白质的氧化之间可能存在着一定程度的相互作用,包括反应产物之间的相互促进作用[31-32]。随着氧化过程的推进,形成的自由基与氨基酸侧链发生羰基化反应,使得蛋白质结构发生变化,从而引起蛋白质溶解度下降[33]。因此在贮藏过程中,脂质氧化产生的活性基团(如氢过氧自由基ROO·,·OO等基团)继续与体系中的物质产生反应,使得肉的品质降低[34]。

对于水分来说,T23、T24与贮藏时间、TVB-N、TBARS、菌落总数之间显著负相关(p<0.05),与蛋白质溶解度之间显著正相关(p<0.05)。T23与贮藏时间、TVB-N、TBARS、蛋白质溶解度、菌落总数、T24之间极显著相关(p<0.01)。T24与T23、贮藏时间、TVB-N、蛋白质溶解度、菌落总数及蒸煮损失均呈现较好的相关性(p<0.05),这也说明了肉中不易流动水、自由水与肉的持水力、保水性、风味等品质指标相关[35-36]。从相关性分析可以看出牦牛肉在贮藏过程中,物理化学性质的变化常伴随着肉中水分子流动性的变化[8]。因此可利用T2弛豫时间进行不同贮藏时间下牦牛肉品质的评定。

3 结论

采用真空包装的牦牛肉,随着冷藏时间的延长,各品质指标与水分及含量都发生明显变化,因此贮藏时间的控制对牦牛肉在冷藏过程中品质变化的影响极为重要。利用低场核磁测得横向弛豫时间T21、T22在贮藏过程中后移,含量减少;T23和T24在整个贮藏期内含量不断减小,变化显著(p<0.05)且当第12 d以后自由水大部分流失。通过相关性分析,T23、T24与贮藏时间、TVB-N、TBARS、菌落总数、蛋白质溶解度之间显著或极显著相关(p<0.05或p<0.01)。因此,利用低场核磁共振技术对牦牛肉冷藏过程中T2横向弛豫时间的变化可知,借助水分含量变化可对牦牛肉在贮藏过程中肉品质的变化进行判断具有一定的可行性。分析水分变化与肉品品质之间的关系,通过横向弛豫时间T2和质子密度变化可实现对真空包装牦牛肉贮藏过程中的品质监测。

此外,本次实验还存在不足之处,实验过程中没有测定肉的质构特性与水分变化的关系、自旋-晶格弛豫时间T1的变化、以及水分活度与水分变化之间的关系,后续将继续深入研究水分变化对牦牛肉脂肪氧化、蛋白质氧化以及质构特性的影响。