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(1.广州市第二中学，广东广州 510080;2.中山大学公共卫生学院,广东省营养膳食与健康重点实验室,广东广州 510080)

葡萄是世界上广泛种植的水果之一,具有多种生物学功能,如抗菌、抗癌、抗氧化、抗炎、保护肝脏和保护心血管等[1-5],深受人们喜爱。此外,葡萄也常用于生产葡萄酒、葡萄汁等产品,工业生产中会产生大量葡萄皮、籽副产物。研究表明,葡萄皮、肉、籽中均含有丰富的植物化学物,尤其是多酚类、黄酮类化合物,如花色苷、白黎芦醇、单宁和槲皮黄酮等,被认为是与葡萄生物学功能相关的活性成分[6-8]。这些天然活性成分具有作用效果强、毒副作用小等优点,适合用于慢性病预防[9-10]。但不同品种葡萄及其不同部位可能具有不同的抗氧化活性和生物活性成分,而目前尚无研究对此进行系统评价。

新疆是我国主要葡萄产地之一,在本研究中,选取产于新疆的11个鲜食葡萄品种作为研究对象,采用铁还原能力试验(FARP assay)和Trolox等效抗氧化能力试验(TEAC assay)分别测定其皮、肉、籽的还原能力和自由基清除能力,用福林酚法测定其总酚含量(TPC),并分析FRAP、TEAC、TPC之间的关系,从而系统评价这11个鲜食葡萄品种抗氧化活性的特点及其主要活性成分。本研究结果将为居民膳食指导提供理论基础,同时为优良葡萄品种的培育和种植及其在功能食品工业中的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

11个鲜食葡萄品种 包括珍珠黑提、珍珠青提、火焰葡萄、无籽露葡萄、红提、巨峰葡萄、无籽红提、无籽黑提、无籽青提、玫瑰香黑提、夏黑葡萄,采购于广州市各超市和水果专卖店;2,2′-联氮双-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis(3-ethylbenothiazoline-6-sulphonic acid)diammonium salt,ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tri(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)、福林酚试剂、没食子酸 美国圣路易斯Sigma公司;四氢呋喃、甲醇、乙醚、乙酸乙酯 天津科密欧公司;冰醋酸、醋酸钠、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、氢氧化钠、盐酸、抗坏血酸、六水三氯化铁、七水硫酸亚铁、过硫酸钾、无水碳酸钠、乙醇、正己烷 天津大茂公司。所用试剂均为分析纯或色谱纯。

XT-A400型粉碎机 永康市红太阳机电有限公司;3-18K型台式离心机 美国圣路易斯Sigma公司;DKZ-450B型恒温振荡水槽 上海森信试验仪器有限公司;N-EVAP111型氮吹仪 德国柏林Oganomation Associates,Jnc公司;9030型电热恒温鼓风干燥箱 广州科桥试验技术设备有限公司;DK-S26型电热恒温水浴锅 广东环凯微生物科技有限公司;722型分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 用双蒸水冲洗葡萄去除果皮上的污物,待果皮表面水分在室温下干燥后,将葡萄分离成皮、肉、籽三个部位,并用粉碎机研磨为均质。

1.2.3 水溶性部分提取 取步骤1.2.2中的残留物,加入10 mL酸化甲醇(甲醇∶冰醋酸∶水=50∶3.7∶46.3/v∶v∶v),摇匀,30 ℃震荡水浴30 min,4200×g离心10 min,收集上清;重复提取2次并混合,作为水溶性部分[11],储存于-20 ℃冰箱,备用。

1.2.4 结合态部分提取 取步骤1.2.3中的残留物,加入5 mL氢氧化钠溶液(2 mol/L NaOH,10 mmol/L EDTA,1%抗坏血酸)水解,30 ℃震荡水浴30 min,混合物加入盐酸(6 mol/L HCl)酸化至pH=2左右,并加入5 mL正己烷,4200×g离心10 min分层后弃去有机相部分,重复2次以除去加碱水解释放出来的脂肪酸;然后加入5 mL乙醚-乙酸乙酯混合溶剂(1∶1/v∶v)提取,4200×g离心10 min分层,收集有机相部分;重复提取2次并混合,然后用氮气吹干溶剂,并用5 mL无水乙醇复溶,作为结合态部分[12],储存于-20 ℃冰箱,备用。

1.2.5 水分含量测定 精确称取研磨后样品2.000 g于预先干燥至恒重的称量皿中,放入电热恒温鼓风干燥箱中65 ℃烘干至恒重,计算样品水分含量(Q),以百分比(%)表示。计算公式为:

Q(%)=(m1+M-m2)×100/M

式中:m1为称量皿质量(g),M为样品质量(g),m2为干燥恒重后称量皿加样品残渣的总质量(g)。

1.2.6 铁还原能力试验(FRAP assay) 参照Benzie等[13]的方法进行FRAP试验,略有改动。样品溶液用双蒸水适当稀释,使最终吸光度落在标准曲线的线性范围。取100 μL稀释后样品溶液加入到3 mL FRAP反应液中,在室温下孵育4 min后用722型分光光度计在593 nm波长下测定吸光度,空白调零液为100 μL双蒸水与3 mL FRAP反应液(孵育4 min)。应用0～2000 μmol/L FeSO4溶液作为参考标准绘制标准曲线,FRAP值换算成μmol Fe(II)/g 干重(DW)样品。计算公式为:

FRAP=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(μmol Fe(II)/g DW)

通过百度指数中显现的人群属性发现，关注“亲子游”用户有以下特征：在性别上，64%的男性和36%的女性网络用户关注亲子游，说明男性较女性更加关注亲子游活动；在年龄上，30—39岁年龄段的用户关注亲子游活动最高，20—29岁、40—49岁的用户分别占18%、14%，19岁及以下、50岁及以上的用户仅占2%、3%，可见，中年人更加关注亲子游活动，并且对亲子游产品的旅游需求多样化，通过网络搜索获取旅游信息是中年人旅游行为的特征之一。

式中:N为样品溶液的稀释倍数,C为样品溶液吸光度对应的Fe(II)浓度(umol/L),V为样品溶液总体积(mL),M为称取样品的质量(g),Q为样品水分含量(%)。

1.2.7 Trolox等效抗氧化能力试验(TEAC assay) 参照Re等[14]的方法进行TEAC试验,略有改动。样品溶液用双蒸水适当稀释,使其能够抑制20%～80%的空白吸光度值(A)。取100 μL稀释后样品溶液加入3.8 mL ABTS反应液中,室温下孵育6 min后用722型分光光度计在734 nm波长下测定吸光度(B),空白调零液为双蒸水,吸光度抑制率X=(A-B)/A与样品溶液浓度成正比。应用0～1000 μmol/L Trolox溶液作为参考标准绘制标准曲线,TEAC值换算成μmol Trolox/g DW样品。计算公式为:

TEAC=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(μmol Trolox/g DW)

式中:N为样品溶液的稀释倍数,C为样品溶液吸光度抑制率对应的Trolox浓度(μmol/L),V为样品溶液总体积(mL),M为称取样品的质量(g),Q为样品水分含量(%)。

1.2.8 总酚含量(TPC)测定 参照Singleton等[15]的方法进行总酚含量测定,略有改动。样品溶液用双蒸水适当稀释,使最终吸光度落在标准曲线的线性范围。取0.5 mL稀释后样品溶液加入2.5 mL福林酚试剂(0.2 mol/L)中,反应4 min后,加入2 mL饱和碳酸钠溶液(约75 g/L),室温下孵育2 h后用722型分光光度计在760 nm波长下测定吸光度,空白调零液为0.5 mL双蒸水加2.5 mL福林酚溶液、2 mL饱和碳酸钠溶液(孵育2 h)。应用0～200 mg/L没食子酸溶液作为参考标准绘制标准曲线,TPC值换算成mg没食子酸当量(gllic acid equivalent,GAE)/g DW样品。计算公式为:

TPC=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(mg GAE/g DW)

式中:N为样品溶液的稀释倍数,C为样品溶液吸光度对应的没食子酸浓度(mg/L),V为样品溶液总体积(mL),M为称取样品的质量(g),Q为样品水分含量(%)。

1.3 数据处理与分析

除含水量测定外,每组实验均重复3次,结果表示为平均值±标准差。应用Excel 2007和SPSS 22进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 11种葡萄的水分含量

11种葡萄皮、肉、籽的含水量如图1所示。11种葡萄的皮、肉、籽含水量差别较大,其中葡萄肉含水量最高,范围是72.35%～85.12%;葡萄皮含水量居中,范围是58.70%～79.02%;11种葡萄中只有巨峰、红提和珍珠黑提三种葡萄有籽,其含水量较低,分别为41.66%、46.42%和46.65%。为避免鲜重中水分对FRAP、TEAC和TPC的影响,后续实验以上三个指标将采用干重值表示。

图1 11种葡萄皮、肉、籽的水分含量(%)Fig.1 Moisture contents(%)of peels,pulps and seeds from 11 grape varieties

2.2 11种葡萄的铁还原能力

如图2所示,11种葡萄皮总FRAP范围是(112.86±5.98)～(658.93±28.63) μmol Fe(Ⅱ)/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、无籽黑提、玫瑰香黑提和夏黑葡萄这5种葡萄皮总FRAP最高,分别是(658.93±28.63)、(483.53±32.20)、(434.47±19.10)、(420.42±29.75)和(339.03±28.00) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。11种葡萄肉总FRAP范围是(6.89±0.39)～(79.04±3.10) μmol Fe(Ⅱ)/g DW;珍珠黑提、珍珠青提、无籽露葡萄、火焰葡萄和无籽青提这5种葡萄肉总FRAP最高,分别是(79.04±3.10)、(36.89±0.78)、(31.99±0.71)、(25.91±1.15)和(25.09±1.05) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。而对于3种葡萄籽,珍珠黑提籽、红提籽和巨峰葡萄籽总FRAP分别为(1608.34±66.55)、(1049.00±36.28)和(723.61±29.20) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。此外,脂溶性部分FRAP通常比水溶性部分FRAP大,结合态部分FRAP通常较小,占总FRAP的比例很小。

图2 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的铁还原能力Fig.2 FRAP values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11种葡萄,葡萄籽总FRAP远大于葡萄皮,而葡萄皮总FRAP也明显大于葡萄肉。

此外,将本研究结果与测定其他天然产物的研究结果相比较(如表1所示),发现葡萄籽总FRAP远比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、野果、野花、蘑菇、中草药的高;其葡萄皮总FRAP比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草药的高;其葡萄肉总FRAP则较小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

表1 天然产物的抗氧化活性和总酚含量比较Table 1 Comparison of antioxidant activities and total phenolic contents of natural products

2.3 11种葡萄的ABTS自由基清除能力

如图3所示,11种葡萄皮总TEAC范围是(37.56±1.17)～(374.52±15.90) μmol Trolox/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、玫瑰香黑提、无籽黑提和夏黑葡萄这5种葡萄皮总TEAC最高,分别是(374.52±15.90)、(227.96±6.04)、(210.33±12.89)、(201.45±6.11)和(197.57±13.72) μmol Trolox/g DW。11种葡萄肉总TEAC范围是(3.02±1.02)～(32.50±1.75) μmol Trolox/g DW;珍珠黑提、珍珠青提、无籽青提、玫瑰香黑提和无籽露葡萄这5种葡萄肉总TEAC最高,分别是(32.50±1.75)、(13.13±0.57)、(12.96±0.35)、(10.32±0.52)和(10.24±0.18) μmol Trolox/g DW。而对于3种葡萄籽,珍珠黑提籽、红提籽和巨峰葡萄籽总TEAC分别为(887.38±36.18)、(548.58±16.43)和(440.00±19.61) μmol Trolox/g DW。此外,脂溶性部分TEAC通常比水溶性部分TEAC大,结合态部分TEAC通常较小,占总TEAC的比例很小。

图3 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的自由基清除能力Fig.3 TEAC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11种葡萄,葡萄籽总TEAC远大于葡萄皮的,而葡萄皮总TEAC也明显大于葡萄肉的。此外,由表1可知,葡萄籽总FRAP远比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、野果、野花、蘑菇、中草药的高;其葡萄皮总FRAP比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草药的高;其葡萄肉总FRAP则较小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

2.4 11种葡萄的总酚含量

如图4所示,11种葡萄皮总TPC范围是(12.09±0.40)～(73.12±4.28) mg GAE/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、无籽黑提、玫瑰香黑提和夏黑葡萄皮总TPC最高,分别是(73.12±4.28)、(72.89±4.73)、(43.16±1.75)、(41.63±2.57)和(34.97±1.30) mg GAE/g DW。11种葡萄肉总TPC范围是(1.51±0.13)～(9.37±0.35) mg GAE/g DW;珍珠黑提、无籽青提、珍珠青提、无籽露葡萄和无籽黑提这5种葡萄肉总TPC最高,分别是(9.37±0.35)、(5.24±0.17)、(4.65±0.08)、(4.26±0.07)和(4.14±0.09) mg GAE/g DW。而对于3种葡萄籽,珍珠黑提籽、红提籽、巨峰葡萄籽总TPC分别为(133.53±1.43)、(95.78±2.95)和(74.01±1.46) mg GAE/g DW。此外,脂溶性部分TPC通常比水溶性部分TPC大,结合态部分TPC通常较小,占总TPC的比例很小。

图4 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的总酚含量Fig.4 TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11种葡萄,葡萄籽总TPC远大于葡萄皮的,而葡萄皮总TPC明显大于葡萄肉的。此外,由表1可知,葡萄籽总TPC远比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、野果、野花、蘑菇、中草药的高;其葡萄皮总TPC比大多数蔬菜、水果、水果皮及种子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草药的高;其葡萄肉总TPC则较小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

2.5 FRAP、TEAC和TPC之间的关系

采用简单线性回归模型分析FRAP、TEAC和TPC之间的关系,评价11种葡萄皮、肉、籽抗氧化活性的特点及主要活性成分,结果如图5～图7所示。对于11种葡萄皮、肉、籽,总FRAP值与总TPC值都具有较好的线性关系(R2分别为0.898、0.843、1.000,p<0.05),表明酚类物质具有还原能力,可以还原Fe(Ⅲ)等氧化剂。相似地,总TEAC值与总TPC值具有较好的线性关系(R2分别为0.840、0.881、0.982,p<0.05),表明酚类物质具有Trolox等效抗氧化能力,可以清除ABTS等自由基。此外,总FRAP值和总TEAC值同样具有较好的线性相关系(R2分别为0.967、0.906、0.981,p<0.05),表明其活性成分同时具有还原能力和自由基清除能力,印证了前述两项结果。以上结果与针对56种蔬菜、56种野果、51种花、50种水果的废弃物(皮和种子)、49种蘑菇的研究结果相似[18-22],原因可能在于酚类是这些天然产物的主要抗氧化活性成分之一;与针对62种水果和223种中草药的研究结果略有不同[17,23],原因可能在于这些水果和中草药的主要抗氧化活性成分不是酚类,而是皂苷类、单萜类等。综上所述,酚类物质是11种葡萄主要抗氧化活性成分,同时具有还原能力和自由基清除能力。

图5 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)总FRAP值和总TPC值的关系Fig.5 Correlations between total FRAP values and total TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

图6 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)总TEAC值和总TPC值的关系Fig.6 Correlations between total TEAC values and total TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

图7 11种葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C) 总FRAP值和总TEAC值的关系Fig.7 Correlations between total FRAP values and total TEAC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

2.6 聚类分析

根据FRAP、TEAC和TPC的结果,采用系统聚类分析,将11种葡萄皮和肉进行归类和描述,其系统树状图如图8所示。结合描述性分析结果,可以将11种葡萄皮和肉按照抗氧化活性强弱及总酚含量高低分成3类。对于葡萄皮,第一类包含1种葡萄,即珍珠黑提,此类FRAP、TEAC和TPC最高,分别为658.93 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、374.52 μmol Trolox/g DW和73.12 mg GAE/g DW;第二类包含4种葡萄,即巨峰、夏黑、无籽黑提和玫瑰香黑提,均为黑皮葡萄,此类FRAP、TEAC和TPC(均值)居中,分别为419.36 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、209.33 μmol Trolox/g DW和48.16 mg GAE/g DW;第三类包含6种葡萄,即红提、无籽红提、火焰葡萄、珍珠青提、无籽青提和无籽露葡萄,为3种红皮葡萄和3种绿皮葡萄,此类FRAP、TEAC和TPC(均值)较小,分别为169.55 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、77.14 μmol Trolox/g DW和19.34 mg GAE/g DW。对于葡萄肉,第一类包含1种葡萄,即珍珠黑提,此类FRAP、TEAC和TPC最高,分别为79.04 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、32.50 μmol Trolox/g DW和9.37 mg GAE/g DW;第二类包含3种葡萄,即珍珠青提、无籽青提和无籽露葡萄,均为绿皮葡萄,此类FRAP、TEAC和TPC(均值)居中,分别为31.32 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、12.11 μmol Trolox/g DW和4.72 mg GAE/g DW;第三类包含7种葡萄,即巨峰、夏黑、无籽黑提、玫瑰香黑提、红提、无籽红提和火焰葡萄,为4种黑皮葡萄和3种红皮葡萄,此类FRAP、TEAC和TPC(均值)较小,分别为14.99 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、7.13 μmol Trolox/g DW和3.24 mg GAE/g DW。由此可以看出,珍珠黑提皮和肉的抗氧化活性和总酚含量都是最高的,黑皮葡萄的皮比红皮葡萄和绿皮葡萄的皮具有更高的抗氧化活性和总酚含量,而绿皮葡萄的肉比黑皮葡萄和红皮葡萄的肉具有更高的抗氧化活性和总酚含量。

图8 11种葡萄皮(A)和肉(B)系统聚类树状图Fig.8 Systematic clustering dendrogram of peels(A),pulps(B)from 11 grape varieties

由以上分析结果可知,酚类物质是使得葡萄具有抗氧化功能的主要活性成分,不同葡萄品种、不同葡萄部位具有不同的抗氧化活性和总酚含量。对于葡萄肉而言,珍珠黑提、珍珠青提、无籽青提、无籽露葡萄和玫瑰香黑提具有较高的抗氧化活性和总酚含量,因此果农可以更多地种植这些葡萄品种,人们可以选择食用这些品种的葡萄以获得更高的营养价值。葡萄皮和籽通常比葡萄肉具有更高的抗氧化活性和总酚含量,因此具有更高的营养价值。人们食用葡萄时可以考虑清洗干净后带皮摄入,以获得更多的营养物质。而由于红葡萄酒是用葡萄肉和皮一起压榨、发酵的,白葡萄酒是用去皮的葡萄肉压榨、发酵的,所以红葡萄酒通常比白葡萄酒营养价值更高,期望通过适量饮用葡萄酒获得某些保健功效的消费者可以选择红葡萄酒。此外,葡萄中的酚类物质除具有抗氧化功能外,还具有抗菌、抗炎、抗癌、保护肝脏和保护心血管等多种生物学功能,将葡萄酒和葡萄汁工业中的副产物(葡萄皮和籽),用于开发生产功能食品,具有重要的经济价值。

3 结论

本研究系统评价了11种葡萄各部位(皮、肉、籽)的铁还原能力、自由基清除能力和总酚含量。研究发现,对于不同葡萄品种,珍珠黑提、巨峰葡萄、无籽黑提、玫瑰香黑提和红提的皮,珍珠黑提、珍珠青提、无籽青提、无籽露葡萄和玫瑰香黑提的肉,具有较高的铁还原能力、自由基清除能力和总酚含量,而三种葡萄籽这三个指标大小顺序为珍珠黑提>红提>巨峰;对于不同葡萄部位,通常这三个指标大小顺序为籽>皮>肉;对于不同溶解性部分,通常这三个指标大小顺序为脂溶性部分>水溶性部分>结合态部分。此外,FRAP、TEAC、TPC两两之间均具有较好的相关关系,表明酚类物质是使得葡萄具有抗氧化功能的主要活性成分,且同时具有还原能力和自由基清除能力。