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(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,北京 100083;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

人工合成抗氧化剂(BHT、BHA等)在食品工业中被广泛使用。但毒理学和生物学研究发现,人工合成抗氧化剂对人体健康有一定的伤害,存在安全隐患[1-2]。因此,很多具有抗氧化性的天然产物及其提取物安全性高,在抗氧化剂研发中极具潜力和应用价值[3-4]。香辛料精油就是其中的一类物质。研究发现,从八角、生姜、胡椒、大蒜等常见香辛料中提取出的精油均具有一定的抗氧化性[5-7]。孜然也是一种常见的香辛料,目前有关其精油抗氧化活性的研究主要集中在几种化学方法上,比如DPPH自由基清除法、β-胡萝卜素-亚油酸体系法等[8-10]。化学抗氧化方法不能反映抗氧化成分在细胞内的作用情况,若探究其在细胞内的生物利用率、吸收和代谢等情况,必须建立相关细胞模型[11-12]。Wolfe等[13]以人体肝癌细胞Hep-G2为实验模型,建立了细胞抗氧化活性评价法。近几年来,该方法已经被广泛的应用于食物和纯植物化学物质等的抗氧化性评价中[14-16]。

国内外很多学者对天然产物体内抗氧化能力进行了评价[17-20],但有关孜然精油主要成分体内抗氧化的研究未见报道。化学方法和细胞模型均属于体外评价方法,并不能反映药物在机体内部的吸收和代谢情况。

本实验室曾利用化学方法对孜然精油及其主要成分的体外抗氧化性进行了探究[21-22],结果发现γ-萜品烯为主要的活性单体,它可以有效清除DPPH自由基,并能在一定程度上延缓β-胡萝卜素的褪色反应。为进一步深入研究γ-萜品烯抗氧化作用的机理,本实验在前期研究的基础上,首先在细胞水平上开展抗氧化评价,通过细胞中荧光强度和氧化应激细胞模型中几种抗氧化酶活性的测定、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的测定,对γ-萜品烯的抗氧化能力进行测定。然后在细胞模型抗氧化实验结果的基础上,向小鼠口服灌胃一定浓度的γ-萜品烯,对其血清和肝脏中的抗氧化酶活性、GSH和MDA含量等进行测定,从而对其体内抗氧化性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

γ-萜品烯标准品 纯度≥ 98.5%,美国Sigma-aldrich公司;人肝癌细胞株Hep G2 中国科学院上海细胞库;细胞冻存管、25 cm2细胞培养瓶、Costar 6孔板、24孔板、黑板透明底96孔板、普通酶标板 美国Corning公司;50%戊二醛溶液 国药集团化学试剂有限公司;30%过氧化氢溶液 西陇化工股份有限公司;2′,7′-二氯荧光二乙酸盐(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ABAP) 美国Sigma-aldrich公司;Hyclone DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS) 赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液(100×)、无菌PBS缓冲液(pH7.2～7.4)、无菌二甲基亚砜(DMSO)溶液、组织/细胞裂解液(高效RIPA)、细胞冻存液、0.1%的结晶紫溶液、蛋白测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、微量丙二醛(MDA)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;高纯二氧化碳、液氮 北京千禧京城销售中心;ICR小鼠 共40只,雄性,体重19～24 g,北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证:SCXK-(京)2012-0001,饲养于SPF级动物实验室。

CKX31倒置显微镜 日本Olympus公司;BP221S精密天平 德国SARTORIUS公司;AgileAid电动移液器 美国ACTGene公司;ZK380型低温低速离心机 德国Hermle公司;2000D型超纯水机 北京市长风仪器仪表公司;TGL-16M高速台式冷冻离心机 湖南省湘仪集团;多功能酶标仪 Tecan集团奥地利有限公司;XK96-A快速混匀器 姜堰市新康医疗机械有限公司;HH-S1数显恒温水浴锅 上海上登实验设备有限公司;YDS-30-125型液氮罐 乐山市东亚机电工贸有限公司;1300 SERIES A2型生物安全柜 美国Thermo Scientific公司;Thermo Forma 370二氧化碳培养箱 美国Thermo Scientific公司;YXQ-LS-100SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;WD-9405B型水平摇床 北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器公司;SIM-F140AY65-PC型制冰机 日本SANYO公司;-80 ℃冰箱 美国NBS公司;温控水浴箱 北京长风公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞体外抗氧化试验

1.2.1.1 细胞内荧光强度的测定 实验根据文献[14]略作修改。

细胞的复苏:将水浴锅预热至37 ℃,迅速取出液氮罐中的Hep G2细胞,将其投入水浴锅中迅速解冻,然后在超净台中,将细胞转移至离心管中,加入3 mL含有10%胎牛血清的培养液,1000 r/min离心5 min。弃掉上清液,加入新培养液,轻轻吹打细胞重悬于培养瓶中,放置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中进行培养,24 h后换液。

细胞传代:当细胞处于对数生长期,生长至80%～90%时弃去细胞培养液,用5 mL PBS洗一次,加入约1 mL胰酶消化3 min,待细胞变圆且贴壁能力下降时,加入5 mL DMEM培养液终止消化,用吸管吹打成单个细胞悬液,转移至离心管中,1000 r/min离心5 min。弃掉上清液,将细胞重悬于新的培养液中,按1∶2 (v/v)移入到细胞培养瓶中,放置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中进行培养。

收集处于对数生长期的HepG2细胞,制成单细胞悬液,接种于黑板底部透明的96孔板中,每个孔约含6×104个细胞,加入100 μL DMEM 培养基。37 ℃下培养2 h后移除培养基,每孔加入100 μL PBS,清洗两次。然后加入新鲜的DMEM培养液、γ-萜品烯样品液、DCFH-DA荧光探针溶液,使得γ-萜品烯的质量浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/mL,DCFH-DA终浓度为25 μmol/L,每个质量浓度设置5个重复,在CO2培养箱(浓度5%、温度37 ℃)中继续培养1 h。然后弃掉培养基,每孔加入100 μL PBS,清洗3次,加入ABAP工作液使 ABAP的终浓度为600 μmol/L,用多功能酶标仪测其荧光值,测定条件:激发波长为485 nm,发射波长为538 nm,1 h内每5 min测定一次。对照组用DCFH-DA和ABAP处理,不加入样品液;空白组仅用DCFH-DA处理,不加入ABAP和样品液，荧光强度=待测组测量值-空白组测量值。

1.2.1.2 过氧化氢诱导Hep-G2细胞氧化应激模型的建立 根据文献[23]中的方法略作修改,具体操作如下:取对数期生长的Hep-G2细胞,制成单细胞悬液,以1×105个细胞/mL的密度接种于24孔板中,每孔1 mL,于CO2培养箱中培养,培养条件如1.2.1.1。当细胞贴壁生长面积达到50%左右时,弃去培养基,加入不同体积的过氧化氢和DMEM培养基,过氧化氢终浓度分别为(10、100、500、1000 μmol/L)。每个浓度设置3个平行孔,以不加过氧化氢的培养基为空白对照,在二氧化碳培养箱中培养4 h。将培养基吸出,用PBS清洗3次,每孔加入1%的戊二醛溶液1 mL,以50 r/min的转速在摇床振荡固定20 min后,弃去戊二醛溶液,加入PBS溶液润洗2～3次。加入1 mL的0.02%的结晶紫溶液,50 r/min摇床振荡染色30 min,用蒸馏水清洗至基本没有颜色。然后加入80%的乙醇溶液将结晶紫溶解出来,595 nm下酶标仪测定OD值，以细胞增殖抑制率确定最佳的H2O2浓度。细胞增殖抑制率的计算如公式(1)所示。

细胞增殖抑制率(%)=[(空白对照OD值-实验组OD值)/空白对照OD值]×100

式(1)

1.2.1.3 细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性的测定 根据文献[24]中的方法略作修改,取对数期生长的Hep-G2细胞,制成单细胞悬液,以1×105个细胞/mL的密度接种于24孔板中培养,培养条件如1.2.1.1,当细胞贴壁生长面积达到50%左右时,弃去培养基,加入一定量的过氧化氢、γ-萜品烯母液以及培养液,使得过氧化氢的浓度为100 μmol/L,γ-萜品烯的质量浓度依次为0.500、0.200、0.100、0.050和0.025 mg/mL,阴性对照组只加入100 μmol/L的过氧化氢培养液,空白对照组加入正常的细胞培养液。CO2培养箱(培养条件如1.2.1)中培养4 h后,弃去培养基,用PBS 清洗两遍,胰酶消化后,在4 ℃、3000 r/min条件下离心5 min,弃去上清液收集细胞,加入100 μL细胞裂解液(高效RIPA∶PMSF=100∶1)在冰上裂解30 min,在4 ℃、10000 r/min条件下离心5 min,收集细胞上清液,按总超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(羟胺法)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(比色法)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)等的说明检测SOD、GSH-Px、CAT等的活性。

1.2.1.4 细胞内MDA、GSH含量的测定 按1.2.1.3所述方法处理细胞,然后依照MDA测定试剂盒(TBA法)、GSH测定试剂盒(微板法)等的说明测定MDA和GSH的含量。

1.2.2 动物实验

1.2.2.1 实验动物分组 根据预实验结果及文献中[25-26]天然产物提取物体内抗氧化剂量,本实验共设置三个浓度剂量组,分别为:高剂量200 mg/kg、中剂量100 mg/kg、低剂量50 mg/kg。将小鼠随机分为4组,每组10只,空白组口服蒸馏水;药物组进行灌胃,连续21 d,给药体积10 mL/kg。

1.2.2.2 小鼠血清、肝脏匀浆的制备 血清:小鼠眼眶取血后,4 ℃下放置约1 h,使血清充分析出,然后4 ℃下3000 r/min离心10 min,分离血清,在-20 ℃冰箱中储存备用;

肝组织匀浆:取血后,脱颈椎处死小鼠,取出肝脏,用预冷的生理盐水洗去浮血,滤纸吸干后在冰浴中用预冷的PBS缓冲液机械匀浆(9 mL PBS,1 g肝脏组织),4 ℃下3000 r/min离心10 min。

1.2.2.3 抗氧化能力相关指标的测定 1.2.2.2中血清和肝组织匀浆的SOD、GSH-Px、CAT的活性以及GSH和MDA的含量利用试剂盒进行测定。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 细胞抗氧化试验结果

2.1.1 细胞内的荧光强度 由图1所示,细胞荧光强度随样品液浓度的增加而下降。统计学分析结果显示,各浓度组样品液的细胞荧光强度与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。根据文献报道[27-28],在类似实验中,Hep-G2细胞内荧光强度之所以降低,是因为药物作用于细胞后,在细胞膜外部结合氧自由基阻止其进入细胞,还能在细胞膜内部与活性氧(ROS·)和过氧化自由基(ROO·)结合,从而防止还原型二氯荧光素(DCFH)被氧化成氧化型二氯荧光素(DCF),减少了带有荧光的DCF的形成。因此,图1结果可以说明,γ-萜品烯能明显降低细胞内的荧光强度,原因就是该物质降低了细胞内自由基或活性氧的水平,抑制了DCFH被氧化为DCF的反应,因而导致荧光强度降低,从而起到了抗氧化作用。这种作用随着γ-萜品烯质量浓度的增大而增强,呈现出良好的剂量-作用关系。当γ-萜品烯质量浓度达到0.500 mg/mL时,抗氧化效果达到最高。但是,随着时间的增长,ROS在细胞体内缓慢积累,同一浓度处理下,荧光强度随着时间的增长而升高,这种变化趋势也和文献报道基本一致[29]。

图1 不同浓度γ-萜品烯对Hep-G2细胞荧光强度影响Fig.1 Effects of different amounts of γ-terpinene on Hep-G2 cellular fluorescence intensity

2.1.2 过氧化氢诱导Hep-G2细胞氧化应激模型的建立 不同浓度的过氧化氢作用于Hep-G2细胞4 h后,细胞存活率如图2所示。由图2可知,当过氧化氢浓度为10、100 μmol/L时,二者的细胞存活率与正常对照组相比没有显著性差异(p>0.05)。而当浓度增加至500、1000 μmol/L时,细胞存活率显著下降(p<0.05),这与韩飞等[30]所报道的结果基本一致。在下一步实验中,选取100 μmol/L的过氧化氢诱导建立氧化应激模型。

图2 过氧化氢对Hep-G2细胞存活率的影响Fig.2 Effects of different concentration of H2O2 on survival rate of Hep-G2 cell 注:不同字母代表组间具有显著性差异(p<0.05),图3～图4同。

2.1.3 细胞内SOD、GSH-Px、CAT的活性 SOD是氧自由基的天然清除剂,广泛存在于生物体的各种组织中,能够消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质,具有抗衰老的效果。由图3A可知,在过氧化氢诱导的氧化应激细胞模型中,不同质量浓度的γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,SOD的活性随着药物浓度的升高而增强。在低浓度(0.025、0.050 mg/mL)处理组中,SOD的活性虽然较阴性对照略有上升,但是差异并不显著(p>0.05)。而在高浓度(0.100、0.200、0.500 mg/mL)处理组中,T-SOD的活性均显著高于阴性对照(p<0.05)。但是,即使药物浓度达到0.500 mg/mL,其SOD的活性仍然显著低于空白对照(p<0.05)。说明γ-萜品烯在氧化应激细胞模型中,可以在一定程度上保持T-SOD的活性。

图3 γ-萜品烯对Hep-G2细胞几种抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of γ-terpinene on antioxdases activity of Hep-G2 cell

GSH-Px也是体内一种重要的过氧化物分解酶,可以将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物。由图3B可知,不同质量浓度的γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,GSH-Px的活性随着药物浓度的升高而增强。在各浓度处理组中,GSH-Px的活性均显著高于阴性对照(p<0.05)。但是,即使药物浓度达到0.500 mg/mL,其GSH-Px的活性仍然显著低于空白对照(p<0.05)。说明γ-萜品烯在氧化应激细胞模型中,可以在一定程度上保持GSH-Px的活性。

CAT是一种酶类清除剂,可以将过氧化氢分解成水和分子氧。CAT广泛存在于动植物的体内,能够保护细胞免于过氧化氢的毒害,是生物防御体系中的关键酶。由图3C可知,不同质量浓度的γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,CAT的活性随着药物浓度的升高而增强。在各浓度处理组中,CAT的活性均显著高于阴性对照(p<0.05)。但是,即使药物浓度达到0.500 mg/mL时,其CAT的活性仍然显著低于空白对照(p<0.05)。说明γ-萜品烯在氧化应激细胞模型中,可以在一定程度上保持CAT的活性。

2.1.4 细胞内MDA、GSH的含量 MDA是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的产物,会引起核酸、蛋白质等大分子物质的交联,从而产生细胞毒性。由图4A可知,不同质量浓度的γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,MDA的活性随着药物浓度的升高而降低。在各浓度处理组中,MDA的含量均显著低于阴性对照(p<0.05)。但是,即使药物浓度达到0.500 mg/mL时,其MDA的活性仍然显著高于空白对照(p<0.05)。说明γ-萜品烯在氧化应激细胞模型中,可以在一定程度上抑制MDA的形成。

图4 γ-萜品烯对Hep-G2细胞MDA、GSH含量的影响Fig.4 Effects of γ-terpinene on MDA and GSH content in Hep-G2 cell

GSH是一种低分子清除剂,是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽,具有清除低分子的作用,并且是GSH-Px和谷胱甘肽疏基转移酶(GST)的底物,为这两种酶分解氢过氧化物所必需,它还能够稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤。由图4B可知,不同质量浓度的γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,GSH的含量随着药物浓度的升高而增加。在各浓度处理组中,GSH的含量均显著高于阴性对照(p<0.05)。但是,即使药物浓度达到0.5 mg/mL,其GSH的含量仍然显著低于空白对照(p<0.05)。说明γ-萜品烯在氧化应激细胞模型中,可以在一定程度上延缓GSH的消耗。

综合以上指标的检测,总结γ-萜品烯在细胞内的抗氧化作用如下:活性氧(ROS·)是生物有氧代谢中的一种副产物,包括含氧自由基、过氧化物和氧离子等。ROS·的产生可以使细胞内的各种氧化酶受到损伤从而迅速失活,GSH的含量也随之降低直至耗竭。同时,ROS·攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化形成MDA。过氧化氢诱导的氧化应激模型中,细胞内部抗氧化体系和体内自由基的平衡被打破,大量ROS·的产生导致了细胞氧化性损伤。γ-萜品烯作用于Hep-G2细胞后,增强了细胞清除ROS的能力,细胞内各种抗氧化酶的活性得到了一定程度上的恢复,比如SOD对超氧阴离子的歧化作用和GSH-PX对过氧化氢的还原作用等均得到了增强。与此同时,细胞生物膜的脂质过氧化作用被有效抑制,MDA的生成量也因此下降。而在刘荣等[24]的实验中,山桃稠李果实花色苷在Hep-G2细胞抗氧化系统中起到的作用和γ-萜品烯刚好相反,该物质在细胞内可以提高荧光强度,降低几种抗氧化酶的活性和GSH的含量,同时提高MDA的含量,这是因为山桃稠李果实花色苷可以引起氧自由基和活性氧的增加。由此可见,药物在细胞内对抗氧化系统的影响,主要取决于对氧自由基和活性氧的调控。不过,γ-萜品烯只能在一定程度上清除体内的ROS·,并不能完全恢复由过氧化氢诱发的细胞损伤。

2.2 动物实验结果

2.2.1 小鼠血清和肝组织中抗氧化酶的活性 由表1可知,与空白组相比,高剂量的γ-萜品烯可以显著提高小鼠血清和肝脏中SOD的活性(p<0.05)。中、低剂量组对SOD的影响并不明显。

表1 γ-萜品烯对小鼠血清和肝组织中T-SOD活性的影响Table 1 Effects of γ-terpinene on T-SOD activity of serum and liver in mice

不同剂量γ-萜品烯对小鼠血清和肝脏中GSH-Px活性的影响如表2所示。在血清中,只有高剂量组可以显著提高GSH-Px的活性(p<0.05)。在肝脏中,高、中剂量组均可以显著提高GSH-Px的活性,且二者之间无显著差异(p>0.05),低剂量组虽然也能提高GSH-Px活性,但与空白组相比并无显著性差异(p>0.05)。

表2 γ-萜品烯对小鼠血清和肝组织中GSH-Px活性的影响Table 2 Effects of γ-terpinene on GSH-Px activity of serum and liver in mice

从表3可以看出,与空白组相比,高、中剂量药物组均能显著提高血清和肝脏中CAT的活性(p<0.05),而低剂量组对CAT的活性并没有显著影响。

表3 γ-萜品烯对小鼠血清和肝组织中CAT活性的影响Table 3 Effects of γ-terpinene on CAT activity of serum and liver in mice

2.2.2 小鼠血清和肝组织中MDA、GSH的含量 不同剂量γ-萜品烯对小鼠血清和肝脏中MDA含量的影响如表4所示。在血清中,高、中剂量组均可以显著降低MDA的水平(p<0.05)。而低剂量组对MDA的含量并没有产生显著影响(p>0.05)，在肝脏中，高、中、低剂量组均可以显著降低MDA水平(p<0.05)。

表4 γ-萜品烯对小鼠血清和肝组织中MDA含量的影响Table 4 Effects of γ-terpinene on MDA content of serum and liver in mice

γ-萜品烯对小鼠血清和肝脏中的GSH含量亦有影响。如表5所示,在血清中，高、中、低剂量组均可以显著提升GSH的含量(p<0.05)。在肝脏中，高、中剂量均能显著提高肝脏中GSH水平(p<0.05),其二者之间的作用效果差异并不显著(p>0.05)。低剂量仍然没有起到明显作用。

表5 γ-萜品烯对小鼠血清和肝组织中GSH含量的影响Table 5 Effects of γ-terpinene on GSH content of serum and liver in mice

综合以上指标可以看出,γ-萜品烯在体内显示出了一定的抗氧化能力。在一定浓度范围下,γ-萜品烯可以提高SOD、GSH-Px和CAT等几种抗氧化酶的活性,同时提高GSH的含量、降低MDA的水平,这与其在氧化应激细胞模型中的作用相似。高、中、低三个剂量组对抗氧化酶活性以及MDA和GSH含量的影响存在差异,与空白组相比,高剂量组对所有指标均体现出了显著的影响(p<0.05),而中、低剂量组则对部分指标产生显著影响。以上结果和文献中[25-26]报道的一些天然产物体内抗氧化的作用一致,说明对抗氧化酶、GSH、MDA等的水平产生影响,是体内抗氧化作用的一种途径。本章实验中,γ-萜品烯在细胞模型和体内实验中的作用相似,均体现出了一定的抗氧化能力,与前期化学方法评价相比,更具说服力。

3 结论

荧光强度测定结果表明,γ-萜品烯可以降低细胞内自由基或活性氧的水平,抑制DCFH被氧化为DCF的反应,从而导致荧光强度降低、起到抗氧化作用。在由过氧化氢诱导建立的氧化应激细胞模型中,γ-萜品烯可以保护SOD、GSH-Px和CAT等几种抗氧化酶的活性,从而在一定程度上恢复由过氧化氢引发的细胞损伤,起到抗氧化作用;在体内抗氧化能力评价实验中发现,高剂量组和中剂量组的γ-萜品烯可以保护血清和肝脏中几种抗氧化酶的活性,从而在体内发挥一定的抗氧化作用。结合本实验室前期工作基础和本文研究结果,说明γ-萜品烯不论在体内还是体外都能发挥一定的抗氧化作用,具备成为天然抗氧化剂的潜力。