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(陕西中医药大学，陕西省中药资源产业化协同创新中心,陕西咸阳 712083)

铁是人体内最重要的元素之一,对人体正常功能尤其是机体代谢和免疫功能[1]的维持具有重要的作用。据世界卫生组织估计,世界上46%处于5～14岁年龄段的儿童和48%的孕妇患有贫血,且大多数属于缺铁性贫血(IDA)[2]。IDA主要是由铁摄入不足、机体对铁吸收不良或铁的过度流失造成的[3]。酸枣(ZiziphusjujubeMiller.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou)是鼠李科枣属植物的一种,广泛分布于我国北方各地,其种仁具有安神补脑的功效,是我国传统名贵中药的一种[4]。因此目前对于酸枣资源的也开发主要集中于其种仁,而研究表明酸枣果肉中亦含有多种活性成分、具有多种功效,其中酸枣多糖具有诸如保肝、抗实验性结肠炎、改善肥胖等作用,因此受到研究者的广泛关注[5-8]。

目前临床用以改善IDA症状的药物主要有亚铁盐如硫酸亚铁、富马酸亚铁和葡萄糖酸亚铁等[9]。但是长期服用此类亚铁制剂会导致恶心、呕吐、腹痛和便秘等胃肠道副作用[10]。在过去的30多年里,糖铁复合物—右旋糖酐铁、蔗糖铁复合物等注射剂被用于改善IDA症状[11-13]。蔗糖铁复合物已在欧洲使用了近50年[14-17],相比于硫酸亚铁盐等补铁制剂相对安全、副作用小,但重复注射右旋糖酐铁可引起肉瘤、无菌脓肿、组织坏死甚至死亡等严重副作用[18]。近年来相关研究人员已对黄芪、枸杞、当归等植物多糖铁复合物进行了系列表征及药理活性研究,研究表明植物多糖可与铁形成稳定的配合物且在生理条件下铁的浓度相对较高,毒副作用较小,是治疗IDA的理想补铁制剂[19]。

而酸枣多糖铁复合物的制备及其药理活性研究较少,本课题组前期通过微波辅助提取了酸枣多糖并对其理化性质做了初步研究[20]。本文将对其药理活性进行初步的探索,为治疗缺铁性贫血提供一种新的补铁制剂,同时为酸枣资源的开发利用提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸枣(10月份成熟后采摘且干燥后使用) 陕西延安;SPF级雄性SD大鼠(重量180～220 g,8周龄，60只) 购自西安交通大学动物实验中心,动物许可证号SCXK(陕)2017-003；DPPH、ABTS 纯度>99%,北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒 纯度>98%,北京索莱宝科技有限公司;铁标准溶液 纯度>99.6%,批号2017082721,国家标准物质中心;力蜚能胶囊(150 mg/粒) 批号171670P1,珠海许瓦兹制药有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

WFX-210火焰原子吸收分光光度计 瑞利,北京;UV-2600紫外-可见光分光光度计 岛津,日本;傅立叶变换红外(FTIR)光谱仪 赛尔默,美国;S-4800扫描电镜 日立,日本;BC-5300兽用血细胞分析仪 迈瑞,深圳。

1.2 实验方法

1.2.1 酸枣多糖铁的制备 酸枣多糖及多糖铁的制备参照文献[20-22]进行,将去核后的干燥酸枣果肉于9倍去离子水中100 ℃提取三次后,合并提取液浓缩至一定体积并采用Sevage法去除蛋白,之后用无水乙醇调节乙醇浓度为80%进行多糖沉淀,沉淀后产物溶于少量去离子水进行透析(14000 Da)以去除小分子单糖,透析产物冷冻干燥后为酸枣多糖(ZJSP)。将1 mL 2 mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入到酸枣多糖与枸橼酸钠的水溶液中,全称刺激搅拌并用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH保持反应液pH为9,1 h后终止反应,将反应产物置于去离子水中透析48 h(14000 Da)后经无水乙醇沉淀,冷冻干燥后所得产物为酸枣多糖铁ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物。

1.2.2 铁含量的测定 铁含量的测定采用火焰原子吸收分光光度法(FAAS),将所测物经浓盐酸及浓硝酸消解后溶于1% HCl中进行含量测定,根据GB/T 11911-1989的方法:波长213.9 nm,灯电流2.5 mA,狭缝1.2 nm,空气流量5 L·min-1,乙炔流量为1 L·min-1,用Fe标准溶液得校准曲线(y=0.0741x+0.0183;R2=0.9994,0.05～0.85 μg·mL-1)。

1.3 酸枣多糖铁结构表征

以葡萄糖为标准品采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[23](y=1.7898x+0.0226,R2=0.9968,0.05～0.35 mg·mL-1);以牛血清为标准品采用Bradford法测定蛋白质含量[24](y=4.1530x+0.6045,R2=0.9996,0.65～1.32 mg·mL-1);以没食子酸为标准采用福林-酚试剂测定总酚含量[25](y=31.2732x+0.0527,R2=0.9996,0～0.06 mg·mL-1);将样品溶解在5%盐酸溶液中进行全波长扫描(200～400 nm);将2 mg样品与200 mg KBr压片后傅进行了红外光谱扫描(4000～500 cm-1),其微观形态采用SEM进行扫描分析。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH自由基清除活性 根据文献[26]报道方法,将1.2.1中制备所得ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物溶于去离子水后过0.45 μm滤膜,将1.5 mL溶液与1.5 mL DPPH(25 mg/L)乙醇溶液经涡旋混合后置于室温25 ℃孵育30 min(空白为去离子水,阳性为VC),于517 nm处测量溶液吸光度。

DPPH自由基清除率按公式(1)进行计算:

式(1)

式中:A0、A1与A2分别为空白溶液、样品溶液初始及终止吸光度。

1.4.2 ABTS自由基清除活性 根据文献[27-28],将1.2.1中制备所得ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物去离子水溶液与4.0 mL ABTS(7 mmol/L)经涡旋混合后置于室温25 ℃孵育30 min(空白为去离子水,阳性为VC)。ABTS 自由基清除率根据公式(2)进行计算:

式(2)

式中:A0、A1与A2分别为空白溶液、样品溶液初始及终止吸光度。

1.4.3 羟基自由基(·OH)清除活性 根据文献[29-30]报道方法,将1.0 mL ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物去离子水溶液分别与1.0 mL FeSO4(9 mmol/L)涡旋混合后先后加入1.0 mL水杨酸乙醇溶液(9 mmol/L)0.05 mL H2O2(9 mmol/L)溶液涡旋混合,置于37 ℃保持30 min(空白为去离子水,阳性为VC),·OH清除率按公式(3)进行计算:

式(3)

式中:A0、A1与A2分别为空白溶液、样品溶液初始及终止吸光度。

1.5 ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物体外释铁性能

ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物体外释铁性能按照文献报道方法进行并做略微改动[31-33],具体操作细节为:先将1 g ZJSP-Fe(III)复合物粉末置于1000 mL人工胃液(2.0 g NaCl,3.2 g胃蛋白酶,80 mL 1 mol/L HCl去离子水稀释至1000 mL,pH=2.0)中2 h,然后改变其pH使其人工肠液8左右(5.0 mL 胆汁盐溶液25.0 g/L,胰腺提取物4.0 g/L,0.1 mol/L NaHCO3调节pH为8),放置3 h,溶液温度始终控制在37 ℃,第1 h每隔20 min取一次样,之后每30 min取一次样,样品过0.45 μm滤膜后经原子吸收测定其中铁含量。铁释放率按照下式进行计算

式(4)

式中:F1为溶液中铁总量,F0为多糖铁中铁含量。

1.6 缺铁性贫血大鼠模型试验

动物实验依据陕西中医药大学实验动物福利实施细则,自由饮食和摄水,每日明暗交替12 h,温度保持(25±1) ℃,适应环境7 d后进行造模。空白组(10只)食用正常维持饲料(Fe 173.12 mg/kg),对其余50只大鼠采用AOAC低铁饲料(Fe 10.37 mg/kg)饲喂,辅以眼静脉放血每周三次[22],造模时间一个月,造模后采用血细胞自动分析仪测定红细胞数量(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)以及红细胞体积分布宽度(RDW),另外采用Elisa法测量血清中促红细胞生成素(EPO)以及Hepcidin含量。将造模成功后的SD大鼠(Hb<110 g/L)随机分为模型组、阳性药力蜚能组(12 mg Fe/kg体重)、ZJSP-Fe(Ⅲ)高中低剂量组(24、12、6 mg Fe/kg体重)，每组10只。阳性药采取临床上治疗IDA广为使用的右旋糖酐铁制剂,各组灌胃给药四周后取眼静脉血测血常规及EPO、Hepcidin血铁含量,比较各组之间差异。

1.7 数据处理

所有数据均表示为平均值±标准误,数据分析采用SPSS 11.0软件,作图选Graph pad prism 5.0,p<0.05 视为有显著性差异,p<0.01视为有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 ZJSP-Fe(Ⅲ)表征

2.1.1 组分分析 以葡萄糖为标准品用苯酚-硫酸法[23]测得其多糖含量为67.31%±2.37%,酸枣多糖铁中铁元素含量为21.37%±0.84%,蛋白含量为2.37%±0.53%,Fe含量为21.37%±0.43%。

2.1.2 UV分析 如图1所示,在280与305 nm处有微弱峰是其中的蛋白的吸收峰[34],与2.37%的蛋白含量相互佐证酸枣多糖为多糖蛋白复合物,因为酸枣多糖中的蛋白已由多次Savage法除去,这与青钱柳多糖含有17种氨基酸[35]可以相互印证,且在235 nm处的吸收峰推测是由于酸枣多糖形成的链状结构缠绕呈类卟啉结构与铁元素结合造成其共轭结构增大,从而导致其特征峰的红移。

图1 紫外全波长扫描图Fig.1 UV full wavelength scanning spectrum

2.1.3 红外图谱分析 红外分光光度法(FT-IR)因其可以提供大量的结构信息而被广泛用于多糖结构的表征[36]。酸枣多糖与ZJSP-Fe(Ⅲ)的红外图谱见图2,与文献[37-38]报道多糖类物质结构信息类似。3223和3256 cm-1处吸收峰是由于-OH伸缩振动,2885、2882 cm-1处吸收峰可归为C-H伸缩振动[39],1728 cm-1处弱吸收峰指示酸枣多糖中的醛酸物质[40]。1586和1593 cm-1处高而尖的吸收峰可能是由于C=C 或 C=O基团的存在[41],在1013 cm-1处吸收峰可归因于C=N键伸缩振动,1728 cm-1处吸收峰可能是由于脂基的存在[42],而889 cm-1处吸收峰可归为酸枣多糖中β-D-葡聚糖的存在[42],在1200～800 cm-1段的精细结构可能是由于其中糖蛋白的存在[43],954、889、644和 663 cm-1处吸收峰推测是由于酸枣多糖络合铁后相对酸枣多糖有所改变,指示有FeOOH基团的存在[44-45]。

图2 红外图谱Fig.2 IR spectrum

2.1.4 形态分析 ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物的形态如图3所示,电镜扫描显示酸枣多糖铁呈片状且有微小粉末吸附在其表面,能谱分析(EDS)图4显示ZJSP-Fe(Ⅲ)中含有丰富的铁元素,重量比和原子数量比可分别达到 36.27%和12.45%,和原子吸收测得其中高达21.37%的铁含量相对应。

图3 酸枣多糖铁电镜照片Fig.3 SEM images of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex注:a(100000×)；b(400000×)。

图4 酸枣多糖铁能谱分析图及元素分析表Fig.4 Energy spectrum elemental analysis of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex

2.2 生物活性

2.2.1 抗氧化活性 如图5a所示,VC对DPPH自由基的清除活性较显著,ZJSP和ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物在10～1000 μg/mL范围内对DPPH具有一定的清除活性,且具有剂量依赖性。VC、ZJSP和ZJSP-Fe(Ⅲ)EC50分别为0.41、4.1和1.47 mg/mL。而在浓度为1000 μg/mL时ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除率高96.37%。图5b为ZJSP-Fe(Ⅲ)的ABTS自由基清除活性,VC、ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)的EC50分别为0.13、16.37、10.21 mg/mL。在浓度为20 mg/mL时,ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除活性高21.28%。由图5c可知ZJSP与ZJSP-Fe(Ⅲ)的·OH清除率要低于VC(EC50为0.021 mg/mL),ZJSP与ZJSP-Fe(Ⅲ)EC50分别为1.73与0.37 mg/mL,在浓度为1000 μg/mL时,ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除率高31.53%。推测ZJSP-Fe(Ⅲ)的清除活性优于ZJSP部分原因是铁与多糖共轭引起的结构变化以及其分子量的改变导致其抗氧化活性增强[46]。

图5 酸枣多糖铁的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of ZJSP-Fe(Ⅲ)注：a.DPPH自由基清除率；b.ABTS 自由基清除率；c.·OH清除率。

2.2.2 体外释铁实验 为研究ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物的铁释放活性,分别在人工胃液(pH2.0)2 h和人工肠液pH8.0)3 h进行体外铁释放试验,铁含量按1.2.2法测定,并计算其释放率。如图6所示,ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物具有良好的释药活性,在人工胃液中作用23 min后,铁的释放率已达50%,1 h后达到82.3%,在人工肠液3 h后释铁率可达89.28%。结果表明,ZJSP-Fe(Ⅲ)配合物具有良好的铁活性。

图6 酸枣多糖铁体外释铁活性Fig.6 Iron release activity of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex

2.3 动物实验

2.3.1 模型的建立 相比较正常饮食组大鼠,缺铁饲料饲养模型组大鼠在第二周开始出现皮肤苍白、反应迟钝,皮毛粗糙稀疏并随时间延长更易脱落。由表1可知，造模后得模型组大鼠体重极显著(p<0.001)低于空白组大鼠,血液学各项指标显示,模型组大鼠RBC、HGB、HCT、MCH均极显著或显著(p<0.01,p<0.05)降低,而MCV(p<0.01)与RDW-CV(p<0.05)显著增加,各结果采用t检验,其中Hb低于100 g/L且p<0.05表明缺铁性贫血大鼠模型各项指标有统计学差异,指示造模成功,随着造模时间的延长,IDA大鼠经过自身调节后,经ELISA检测,结果显示模型组大鼠血液中EPO水平比空白组高11.17%,Hepcidin含量下降可达3.6%,Hepcidin受缺铁、贫血及缺氧等影响而在大鼠体内表达减少,从而促进肠道吸收和促进铁的释放,可以满足机体对铁元素的需求。

表1 造模后大鼠机体各项指标变化Table 1 Changes of physiologic Indexes in rats after model establishment

2.3.2 体重增量的改变 图7所示为给药后各组的体重增量的比较,由图6可知:模型组的体重增量显著(p<0.05)低于空白组,显示缺铁性贫血会影响大鼠的生长发育,这与文献[47]报道的IDA大鼠模型显示较差的食欲和较慢的生长速度相一致。这可能是由于铁元素的缺乏会影响酶的活性或细胞的氧的供给,从而降低了机体的能量代谢[48]。不同剂量的ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物给药组相对于模型组的体重增量有显著增高(p<0.05),其中低剂量ZJSP-Fe(Ⅲ)相比较模型组p=0.0371,中剂量为0.0087,高剂量为0.0059并且中高剂量组的体重增量和空白相比p值分别为0.3721与0.5127,指示无显著性差异,结果显示ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物对于IDA大鼠模型具有良好的改善其缺铁性贫血状态的作用。

图7 不同组大鼠的体重增量比较Fig.7 Body weight changes of rats in different groups注:#表示模型组与空白组相比有显著性差异,p<0.05;##表示模型组与空白组相比有极显著性差异,p<0.01;*表示给药组与模型组相比有显著性差异,p<0.05;**表示给药组与模型组相比有极显著性差异,p<0.01;图7～图9，表2同。

2.3.3 血液指标的改变 促红细胞生成素(EPO)又称红细胞刺激因子、促红素,是一种人体内源性糖蛋白激素,可刺激红细胞生成[49],由图8可知:模型组大鼠血清EPO水平相比较空白组相比p=0.00874,指示其显著降低,这与模型组大鼠血中红细胞数量较少相吻合,而阳性药力蜚能组与ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物高中低剂量组均能显著增加大鼠血清中EPO含量,且其水平与空白组相比无显著性差异。

图8 酸枣多糖铁给药后EPO变化Fig.8 Changes of EPO after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

Hepcidin是一种抗菌肽,其在机体铁代谢调控中具有重要的作用,现已成为血色素沉着症(Hereditary hemochromatosis,HH)、慢性贫血(ACD)等铁代谢障碍性疾病研究的关键靶分子。由图9可知，在本实验中,模型组大鼠血清中Hepcidin水平相比较空白组p=0.00723指示显著增高,因此导致大鼠血中红细胞数量较少,而阳性药力蜚能组大鼠血清中Hepcidin水平较模型组有大幅降低,且与空白组无显著性差异,ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物高中低剂量组对模型大鼠血清Hepcidin有降低趋势,有一定的剂量依赖性,且中高剂量ZJSP-Fe(Ⅲ)复合物给药组大鼠血清较模型组有显著(p<0.05)降低。

图9 酸枣多糖铁给药后Hepcidin水平变化Fig.9 Changes of Hepcidin contents after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

由图10可知,模型组大鼠血中铁元素含量较空白组相比p=0.0021,指示显著降低,而与阳性药组及ZJSP-Fe(Ⅲ)中高剂量给药组相比较模型组有极显著性差异,且与空白组相比已无显著性差异。

图10 酸枣多糖铁给药后血中铁含量变化Fig.10 Changes of blood iron contents after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

表2为不同组大鼠眼底静脉丛取血测得血常规指标,由表可知,模型组大鼠相比较空白组大鼠其RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC等指标均有降低趋势,其中RBC、HGB、HCT三个指标降低较明显(p<0.05),而MCV、RDW-CV、RDW-SD略有升高。在不同剂量ZJSP-Fe(Ⅲ)给药组大鼠中,RBC、HGB、HCT、MCV均有不同程度改善,但MCH与RDW-SD较模型组无显著性变化。总体表明不同剂量ZJSP-Fe(Ⅲ)给药组大鼠能有效改善IDA大鼠体内RBC、HGB、HCT、RBC、HGB、HCT、MCV等指标,且随着剂量的增加,其改善效果逐渐增强且与阳性药效果接近。

表2 酸枣多糖铁给药后血常规指标变化Table 2 The changes of blood routine after the administration of ZJSP-Fe(Ⅲ)

3 结论

实验制备的酸枣多糖铁复合物在体外具有一定的抗氧化活性与良好的体外释铁性能,针对IDA大鼠模型实验显示制备的酸枣多糖铁复合物能够有效改善大鼠血清中的EPO、Fe、RBC、HGB、HCT、MCV等指标水平,且有效降低了大鼠血清中Hepcidin的水平,因此酸枣多糖铁复合物有望成为一种安全有效的新型补铁剂应用于缺铁性贫血研究,且需要进一步动物实验来研究其改善大鼠缺铁性贫血水平的机理。