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(海南大学食品学院,海南海口 570228)

抗生素(Antibiotics)是一类用于抑制或杀死存在于人和动物体内细菌的天然、半合成或合成化合物[1],使用后暴露于环境中将诱导抗性基因产生和传播,严重威胁生态平衡及人类健康[2-3]。抗生素抗性(Antibiotic Resistance)指微生物可耐受抗生素的抑制和致死作用进而存活和繁殖[4],按来源可分为两种:一是源于抗生素生产菌的先天性抗性,以随机突变或表达潜在抗性基因等方式使细菌体内基因组上的抗性基因原型、准抗性基因或潜在抗性基因表达而实现[5-6];二是获得性抗性,由抗生素或抗性基因的接触和交流所导致。抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)是抗性传播和发展的媒介,先天性ARGs经后代垂直转移,获得性ARGs通过食物链水平转移[7-9]。抗性基因的水平转移是群落中菌株产生多重耐药性[10]的一个重要原因。

就益生菌而言,抗生素抗性有利有弊。畜禽养殖业常将益生菌作为饲料添加剂与抗生素配伍使用[11],以避免抗生素的某些副作用,提高动物生产性能。Zhang等[12]在肉鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),结果表明饲喂Bacillussubtilis的肉鸡在第22～35 d,和整个研究期间分别有5.3%和3.3%的体重增加。滥用抗生素导致肠道菌群失调,提高病原菌入侵风险;益生菌调节肠道微生态平衡、促进机体免疫健康[13]。两者相互作用时,抗生素抗性有助于菌株免于抗生素抑制的不利影响,提高在胃肠道中的存活率,长期定植以发挥预期作用。菌株抗性研究有助于益生菌资源的安全、合理及有效使用。抗生素在医学领域的广泛使用引发了对生物安全性的严重关切[14],如今抗生素抗性问题也是乳酸菌研究的重要内容。1999年,Netherwood等[15]提出肠道细菌之间可发生抗性基因的水平转移。Shalini等[16]对乳酸菌抗性的综述认为,较多的乳酸菌菌株含有抗性基因,包括发酵乳中的乳酸菌,它们在人体肠道中大量存在,直接接触到肠道微生物群落。因此抗性基因可能水平转移到肠道内的病原体使得携带抗性基因的益生菌成为潜在致病菌,导致抗生素交叉抗性[17]。

Lactobacillusplantarum属于乳酸杆菌,常见于乳制品、果蔬、肉类及人体肠道中,因优良发酵特性及多种益生作用被广泛应用于工业生产、食品发酵及医疗保健等领域[18-19]。L.plantarumHNU082分离自我国海南省黎族聚居地自然发酵食品鱼茶,其基因组已完全测序(登录号:PRJCA000348),编码丰富的碳水化合物活性酶和磷酸转移酶系统有助于菌株竞争肠道中的营养物质,并且该微生物的生理学和功能方面特性已在体外和体内充分表征,具有益生菌发育的巨大潜力[20]。

本文模拟不同抗生素的环境选择压力[21]对菌株存活及生长情况的影响,同时在分子水平上挖掘相关抗性基因数据,分析了抗性基因与抗性程度之间的关系,旨在为益生菌的体外安全评估和合理应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L.plantarumHNU082 分离自海南鱼茶;MRS肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司;盐酸克林霉素、红霉素、头孢唑啉钠、氯霉素、盐酸土霉素、诺氟沙星、罗红霉素、盐酸四环素、利福平、羧苄青霉素钠、万古霉素 北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、乙酸钠 分析纯,广州化学试剂厂;甲醇、异丙醇、氢氧化钠、氯化钠、苯酚、氯仿、异戊醇 分析纯,西陇科学股份有限公司;含二甲苯菁和溴酚蓝双染料6×DNA loading buffer 北京康为世纪生物科技有限公司;核酸染料(Goldview) 美国AMERCO公司;琼脂糖 北京天根生化科技有限公司;琼脂 上海百赛生物技术有限公司;蛋白酶K、SDS、TBE缓冲液、Tris-HCL、CTAB、EDTA 上海吉至生化科技有限公司。

HN-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;85-1恒温磁力搅拌器 常州澳华仪器有限公司;SW-TFG12通风柜 苏州苏净集团公司;DYY-8C电泳仪 北京市六一仪器厂;DP72双目生物显微镜 OLYMPUS;Hettich32R台式高速冷冻离心机 德国ZENTRIFUGEN;Cell Biosciences凝胶成像分析系统 Alphalmager MN;FA-1604电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司;FST-RO精密型超纯水机 普利菲尔应用材料有限公司;BIO-DL移液器 上海卡耐兹实验仪器设备有限公司;G154DW高压蒸汽灭菌锅 厦门致微仪器有限公司;XH-D漩涡混合器 江苏康健医疗用品有限公司;LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;THZ-100B恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司;UV759紫外可见分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化 将冻存的L.plantarumHNU082菌株接种于MRS液体培养基,37 ℃恒温静置培养36 h待培养液明显浑浊或菌体沉淀后,于-4 ℃保存备用。

1.2.2 DNA提取 采用CTAB法和液氮冻融法[22]提取菌株基因组总DNA。取1 mL菌体培养物于灭菌EP管中,离心(4 ℃,8000 r/min,3 min)弃上清,收集菌体;加入500 μL TE缓冲液(pH8.0),振匀后置液氮中速冻1 min取出,放入65 ℃水浴融化,重复冻融3次;加入80 μL SDS(10%,w/v)和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL),37 ℃水浴4 h后取出;加入100 μL NaCl溶液(20 mg/mL)和80 μL CTAB溶液(10 mol/L),混匀后65 ℃水浴20 min,得到DNA粗提取液;加入750 μL苯酚/氯仿/异戊醇溶液(25∶24∶1,v/v),轻轻颠倒摇匀1 min,静置2 min,重复4次,至无气泡;离心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清至灭菌EP管中;加入500 μL氯仿/异戊醇溶液(24∶1,v/v),混匀1 min,静置2 min,重复3次;离心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清,加入500 μL预冷异丙醇和50 μL乙酸钠(3 mol/L),混匀,于-20 ℃静置30 min后离心(4 ℃,12000 r/min,10 min),弃上清得DNA沉淀并用乙醇(70%,v/v)洗涤;烘箱干燥10 min取出,用30 μL TE溶液回溶置于-20 ℃保存。

1.2.3 DNA纯度检测及抗性基因检测 取DNA提取物与6×DNA loading buffer各2 μL混合,加样于预先制备的1%琼脂糖凝胶点样孔,电压100 V,0.5×TBE电泳液条件下电泳20 min,电泳后于紫外灯下观察,对所提DNA的浓度及纯度进行检测后送至上海美吉生物医药科技有限公司全基因组测序。根据测序结果统计各基因出现次数,并由此计算基因的出现频率(抗性基因出现次数/抗性基因出现总数)以及各类抗生素相关抗性基因出现次数占抗性基因出现总数的百分比(某类抗生素相关基因出现次数之和/所有抗性基因出现总数)。

1.2.4 植物乳杆菌抗生素抗性的检测

1.2.4.1 抗生素配制 根据抗性基因检测结果,结合抗生素的分类[23]及应用情况,选取各抗生素大类中极具代表性的11种常用抗生素(见1.1)进行筛选。抗生素现配现用,分别称取各抗生素0.128 g,于3 mL溶剂(表1)中溶解并用MRS液体培养基定容至50 mL,制成2560 μg/mL母液。准确移取4 mL培养基于试管中,121 ℃灭菌后冷却至室温。将抗生素母液逐步稀释,取4 mL培养基与4 mL抗生素母液(2560 μg/mL)混合均匀,制得1280 μg/mL溶液;取4 mL培养基与4 mL浓度为1280 μg/mL的抗生素溶液混合均匀,制得640 μg/mL溶液;同理稀释为12个浓度梯度:1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL。所有试管溶液体积均为4 mL,每个浓度10支试管。

表1 抗生素配制所用溶剂Table 1 Solvents for antibiotic preparation

1.2.4.2 吸光度检测 分别取200 μL菌液接种于各含抗生素的培养基及阴性对照管(不含抗生素的培养基)中,震荡均匀,阴性对照管接种混匀后于-20 ℃冻存,备用,实验管于37 ℃、120 r/min摇床培养16 h。从培养0 h起,及此后每4 h取出实验管测定600 nm时吸光度,以溶解震匀的阴性对照管校零。共获得0、4、8、12、16 h共5个时间点的吸光值,绘制菌体的动态生长曲线。

1.2.4.3 抗生素MIC筛选 根据吸光值的变化所反映菌体的生长情况,选取吸光度值从近似零突增至某值的明显变化范围内所含的全部抗生素浓度,作为抗生素抑制浓度验证值。按上述各浓度梯度抗生素溶液的配制法,制得比验证浓度高一个梯度的抗生素溶液各5 mL。另有若干含有5 mL琼脂培养基的25 mL锥形瓶,灭菌备用。将各抗生素溶液分别迅速倒入各锥形瓶中,摇匀后分别迅速倒入培养皿,轻微晃动避免产生气泡。平板冷却后,移取100 μLL.plantarumHNU082菌液涂布,于37 ℃厌氧条件下培养48 h。观察平板菌落生长情况,寻找两个相邻验证值使得较低浓度下有试验菌生长(PCR检验),若其中较高的浓度下无试验菌生长,则该较高浓度为抗生素MIC。若首次选取的验证值不符合筛选条件,则据平板结果逐步放大验证值选取范围,直到确定出菌株抗生素抗性与敏感性的临界值。

1.3 数据处理

所有抗生素各时间点下每个浓度2个平行,测定结果以平均值±标准差表示。采用Origin 8.0和Microsoft Excel 2010进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株抗性基因检测结果

全基因组测序结果表明,L.plantarumHNU082中存在9类抗生素的抗性基因,共12种(表2)。抗性基因检测总频数为15次,其中lmrD和macB基因分别出现2次和3次,其余基因各出现一次。各基因出现频率大小有所不同,lmrD和macB分别为13.0%、20.0%,其余基因为6.7%。氟喹诺酮类、林可酰胺类和大环内酯类抗生素相关基因检测频数占基因检测总频数的比例同为最高,达20.0%,其余均为6.7%。

表2 植物乳杆菌HNU082抗性基因检测结果Table 2 Resistance gene detection results of L.plantarum HNU082

2.2 菌株的抗生素抗性

2.2.1 抗生素培养菌株生长曲线 菌株在各抗生素培养条件下的生长曲线(图1),反映菌体的生长状态和数量变化趋势,通过观察在不同浓度抗生素条件下菌株生长情况随培养时间的变化,可确定菌株耐受与敏感界限,分析其抗性表达情况,从而对抗生素MIC范围做出初步判断;当抗生素浓度较高时,菌株数量几乎不随时间的增长而增加,即菌株的生长繁殖受到抑制;而抗生素浓度降低至某一浓度时,菌株数量开始呈现出上升趋势,即在该浓度下表现出抗性。由图1可见,当盐酸克林霉素、红霉素、头孢唑啉钠、氯霉素、盐酸土霉素、罗红霉素、盐酸四环素以及羧苄青霉素钠等8种抗生素的浓度分别降至20、10、5、5、10、10、10、5 μg/mL时菌株展现出良好生长趋势,随着培养时间的延长及抗生素浓度降低,菌体数量增长愈加明显;诺氟沙星和万古霉素浓度的变化对菌株的生长几乎不产生影响,1280 μg/mL条件下,随培养时间的增加试验菌的数量不断上升,即最大浓度仍不能抑制菌体生长繁殖,MIC>1280 μg/mL;而利福平的抑制作用显著,0.625 μg/mL条件下菌株仍无法良好生长,MIC<0.625 μg/mL。

图1 菌体生长曲线Fig.1 Growth curves of the strain 注:A～K依次表示盐酸克林霉素、红霉素、头孢唑啉钠、氯霉素、盐酸土霉素、诺氟沙星、罗红霉素、盐酸四环素、利福平、羧苄青霉素钠、万古霉素。

2.2.2 抗生素MIC值的确定 根据吸光值曲线选定各抗生素平板验证浓度范围(表3),结合验证结果(图2、图3)得到L.plantarumHNU082对11种抗生素的MIC(表4)。盐酸克林霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、罗红霉素MIC为20 μg/mL,氯霉素、头孢唑啉钠、羧苄青霉素钠、红霉素MIC为10 μg/mL,诺氟沙星和万古霉素在1280 μg/mL最大实验浓度下仍不能抑制试验菌生长,因此MIC>1280 μg/mL,同理利福平0.625 μg/mL最小浓度下试验菌仍被抑制,MIC<0.625 μg/mL。在相同的实验条件下,菌株对不同抗生素表现出不同的抗性特征。结合表1,红霉素、罗红霉素同是大环内酯类抗生素,均与macB基因有关,但二者MIC却不同,即菌株对受相同基因影响的同类抗生素的不同药物,也表现出不同的抗性程度。MIC范围内的浓度值越小,则抗生素的抑制作用越明显,菌株抗生素抗性越弱;相反,MIC值越大表示菌株抗生素抗性越强。

表3 抗生素抑制浓度验证范围Table 3 Verification ranges of antibiotic inhibition concentration

图2 抗生素抑制情况Fig.2 Antibiotic inhibition

图3 抗生素耐受情况Fig.3 Antibiotic resistance

表4 各抗生素最小抑制浓度Table 4 MIC of antibiotics to L.plantarum HNU082

2.3 抗生素抗性与抗性基因的关系

抗生素MIC值反映菌株的抗生素抗性特征,根据菌株的抗性基因检测结果,分析抗生素抗性与相应抗性基因的关系:

万古霉素和诺氟沙星MIC>1280 μg/mL,菌株所表达的抗性最为明显,万古霉素相关抗性基因mprF占所检测基因的6.7%,而诺氟沙星相关抗性基因arlR、emeA、gyrB占所检测基因的20.0%;此外,lmrC和lmrD与盐酸克林霉素有关,占所检测基因的20.0%,但盐酸克林霉素MIC为20 μg/mL。菌株对上述抗生素均表达出了一定的抗性,基因检测频率相同时,抗性特征却不同,因此抗性程度与相关抗性基因所占比重之间无直接联系。

在菌株L.plantarumHNU082中,盐酸四环素和盐酸土霉素抗性与mepA有关,MIC均为20 μg/mL;头孢唑啉钠和羧苄青霉素钠抗性与pbp1a有关,MIC均为10 μg/mL,而macB是红霉素和罗红霉素的相关抗性基因,红霉素与罗红霉素MIC分别为10、20 μg/mL,菌株对罗红霉素的抗性强于红霉素;因此对于受同一基因影响的不同抗生素,菌株的抗性特征也不相同,抗生素抗性因药物不同存在差异,抗性基因不是决定抗性特征的绝对因素。

除上述抗生素外,菌株对与fexA相关的氯霉素也具有一定的抗性,而利福平的抑制作用极其明显,菌株极不耐受,未表达出抗性。通常认为抗性基因的存在与抗生素抗性的表达之间具有一定的联系,但实验结果表明,并非所有的抗性基因均会表达出相应的抗性。

3 讨论

抗生素抗性表型和抗性基因之间并不存在绝对的相关性。一方面抗生素抗性是基因、移动元件及其细菌宿主之间复杂相互作用的结果,同时伴随着人类为控制细菌生长而施加的强烈选择压力[24],这为本实验中菌株存在rpoB基因却未体现出相应抗性提供了合理解释;另一方面先天性抗性菌株可能具有抗生素抗性表型而不含相应抗性基因[25]。邵玉宇[26]在植物乳杆菌链霉素抗性基因的相关研究中提到,植物乳杆菌IMAU60045和IMAU80091均携带有aadA和ant(6)基因,但对链霉素表现出的耐药性却完全不同,该结果与本实验中的发现一致。通过不断增加培养基中链霉素浓度进行30 d传代培养,发现IMAU60045的耐药性增加了1024倍,所以在不同条件下,同一基因相关的抗性特征也会发生变化。某些关于抗性基因与抗生素抗性的相关研究还表明,一种抗性基因不仅是对一种特定药物产生抗性,还能对其他结构相似药物存在抗性。不同类的抗生素可能有相同的作用位点,这些位点如果被抗性基因修饰,就会出现交叉抗生素抗性。

有研究[27]报道,乳酸菌菌株的抗生素抗性存在种间特异性而不存在地区特异性,在同一种内,分离自不同地区的菌株的抗生素抗性的差异性较小;宋晓敏等[28]在综述中对乳酸菌各属针对不同抗生素的固有耐药性进行了总结,乳杆菌属具有抗性的相关抗生素包括肽类万古霉素、β-内酰胺类头孢噻、氟喹诺酮类氟哌酸和环丙沙星等,与本实验植物乳杆菌抗性基因的检测结果相一致。因此本实验关于植物乳杆菌抗生素抗性及其相关基因的研究结果,理论上可为其他植物乳杆菌的相关研究给予参考。

本实验采用试管稀释法、分光光度法并结合平板验证的方式对植物乳杆菌进行11种抗生素抗性的筛选,严格控制微生物培养条件和吸光度测定时间点,以提高MIC测定结果的准确性和可靠性。但乳酸菌抗生素抗性的测定方法不唯一,许多研究者借鉴致病菌耐药性测定的标准与方法,如K-B纸片扩散法、打孔法、牛津杯法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-test法[29-30],其中K-B纸片扩散法、打孔法及牛津杯法以抑菌圈直径为测定指标,但存在结果不稳定及操作复杂等缺陷,而肉汤稀释法、琼脂稀释法及E-test法以MIC、MBC为测定指标,具有测定准确重复性好等优点,但工作量大,肉眼难以观察。目前对乳酸菌耐药性的研究逐渐受到人们的重视,对耐药性检测方法的研究也必不可少,需要调整、改良现有方法或采用多重方法结合,使其更适用于乳酸菌抗性检测。

4 结论

HNU082在分子水平上存在arlR、emeA、fexA、lmrC、lmrD、macB、mepA、mprF、novA、pbp1a、gyrB、rpoB等抗生素抗性基因;盐酸克林霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、罗红霉素MIC为20 μg/mL,氯霉素、头孢唑林钠、红霉素、羧苄青霉素钠MIC为10 μg/mL,诺氟沙星、万古霉素MIC>1280 μg/mL,利福平MIC<0.625 μg/mL。在相关基因存在的情况下,菌株对盐酸克林霉素、氯霉素、头孢唑啉钠、红霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、罗红霉素、羧苄青霉素钠、诺氟沙星以及万古霉素等抗生素具有抗性,且对万古霉素和诺氟沙星的抗性最强,但对利福平未表达出相应抗性。菌株抗性程度与抗性基因所占比例大小无关;针对包括受同一基因影响的不同药物,菌株的抗性特征也各不相同;抗性基因的存在一定程度上反应了菌株表达抗生素抗性的可能性,但抗生素抗性表型与抗性基因之间的关系并不绝对;且抗生素抗性特征不是菌株的固定属性,表型抗性将会受环境或其他条件的影响发生变化。