曾丽萍，田文妮，夏雨，黎攀，杜冰，*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东中山528437）

山药，薯蓣科，又称薯蓣、白山药等。山药富含多种营养及功能活性物质，如多糖、尿囊素等。山药多糖是山药中的主要活性成分，具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用[1-2]。但由于山药水分含量高，难以长时间保存，因此往往需要对山药进行干制处理，能够有效延长山药的贮藏期[3-4]。山药在加工中极易产生褐变，影响其品质。目前常用于山药护色的褐变抑制剂主要是含硫护色剂，其中亚硫酸盐不仅能够有效抑制酶促反应，还能抑制非酶褐变，从而延缓或者抑制褐变的发生，因此尤其受到广泛的应用。尽管采用含硫护色剂能够取得很好的护色效果，但是产品中可能存在的残硫量超标的问题，严重影响产品品质，还可能带来食品安全问题[5]。因此，选用合适的非硫护色剂能够有效保障山药加工的品质。

现有研究表明，加工过程中不同的处理手段可能影响山药多糖的得率和山药多糖的活性[6]，但目前多集中与研究提取方式对于山药多糖的影响。护色方式对于山药多糖的影响上未见报道。因此找寻合适的非硫护色剂对山药进行护色，并探究其对山药多糖的含量和活性的影响尤其重要。本研究采用产乳酸芽孢杆菌发酵液为原料，制备新型护色剂对山药多糖进行护色，并探究其与传统含硫护色对山药多糖活性的影响，为山药的护色工艺的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药：河南焦作；产乳酸芽孢杆菌DU-106 筛选自传统发酵奶酪，现由华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心鉴定及保藏；葡萄糖标准品：sigma 试 剂 公 司；DMEM （dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培养基：美国Gibco 公司；无水乙醇：广州化学试剂厂；CCK-8 试剂盒：日本同仁化学研究所；细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）试剂盒：欣博盛生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4 数显恒温水浴锅：常州市华普达数学仪器有限公司；ANKE TDL-5-A 离心机：上海安亭分析仪器有限责任公司；752-N 紫外分光光度计：上海精密仪器有限公司；Labserv K3 酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DHP-600 电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；FA2004A 分析天平：上海精天电子仪器厂；HH-8 数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；WYT 手持糖量计：早州中友光学仪器有限公司；VD-650 桌上式洁净式工作台：苏州净化设备有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

挑选大小一致、无创伤、无病虫斑的块茎，用清水洗净、淋干，迅速切成2 mm 左右厚的薄片，分别用不同的护色液处理一定时间后，置于70 ℃烘箱中烘干至恒重，得干山药片备用。

1.3.2 发酵护色液的制备

1.3.2.1 产乳酸芽孢杆菌发酵液制备

分别称取乳清粉20 g、葡糖糖10 g、硫酸镁1 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸锰0.5 g 溶解于一定量的水中，定容至1 L，分装灭菌，得发酵培养基。

将产乳酸芽孢杆菌接种至发酵培养基中，接种量为0.1%，置于180 r/min，37 ℃摇床中液体发酵一定时间后取出，取出后采用0.22 μm 滤膜过滤，得产乳酸芽孢杆菌发酵液。

1.3.2.2 混合

将1.3.2.1 所得的产乳酸芽孢杆菌发酵液按照一定要求加水混合均匀，得发酵护色液。

1.3.3 护色工艺单因素

按照1.3.2 的方法分别考察发酵液发酵时间、发酵液添加量、护色时间3 个因素对山药的相对褐变度和多糖含量的影响。当探究发酵时间变化对相对褐变度和多糖含量影响时，发酵液添加量为10%，护色时间为1 h；探究发酵液添加量的影响时，发酵液发酵时间均为36 h，护色时间1 h；探究护色时间的影响时，发酵液发酵时间为36 h，发酵液添加量为10%。

1.3.4 响应面优化

在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对护色工艺进行进一步的优化。根据Box-Behnken 试验设计原理[7]，选取发酵液发酵时间（A）、发酵液添加量（B）、护色时间（C）3 个因素为自变量，以多糖得率（Y1）和相对褐变度（Y2）为响应值，进行三因素三水平的响应面试验分析，得到最佳护色工艺。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 山药多糖的提取

将干山药片经粉碎机粉碎后过20 目，精密称取适量处理后的干山药片，按料液比1∶60（g/mL），沸水浸提2 h 两次，抽滤合并滤液，用3 倍体积的95%乙醇，醇沉过夜，沉淀物用75%乙醇洗涤两遍后，用50 mL水把沉淀物洗入回流瓶中，加入25%盐酸15 mL，沸水回流水解2.5 h，水解液定容至100 mL，取1 mL 测定多糖含量。

1.3.6 多糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定山药多糖含量[8-9]。

以葡萄糖标准品绘制标准曲线，以葡萄糖当量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作回归曲线，线性回归方程为：y=9.865 6x+0.012 3，R2=0.999。

1.3.7 相对褐变度测定

褐变度测定方法参考刘丽芳[10]，采用相对褐变度[11]来表述山药的褐变程度。相对褐变度按下式计算：

式中：A护色为经护色液处理后的样品按照褐变度测定方法处理后在420 nm 下的吸光度值；A空白为经清水处理后的样品按照褐变度测定方法处理后在420 nm下的吸光度值。

1.3.8 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定

将山药块茎用清水洗净、淋干后迅速切成2 mm左右薄片，分别用A：对照组（蒸馏水）；B：0.1%亚硫酸钠（含硫对照）；C：发酵护色液（经由响应面试验优化所得最佳工艺）浸泡护色1 h，参照赵喜亭等[12]的方法提取粗酶液并测定PPO 和POD 酶活。

1.3.9 山药多糖免疫活性试验

1.3.9.1 RAW264.7 细胞的培养与模型的建立

参考chen 等[13]的方法培养RAW264.7 细胞，略有调整。其中调整细胞密度为1.0×105个/mL 在96 孔板毎孔加入100 μL 的细胞悬浮液，培养24 h 后，然后按不同组别将入100 μL 的梯度浓度（2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL）的山药多糖培养液孵育24 h，分别为空白对照组：含10%胎牛血清的DMEM培养基和实验组：含10%胎牛血清的DMEM 培养基中加入不同质量浓度的经由不同护色处理的山药中提取的粗多糖。其中，清水处理山药多糖组（CYH）：加入从清水浸泡处理的山药中提取的粗多糖；亚硫酸钠处理山药多糖组（CYN）：加入经亚硫酸钠护色处理的山药中提取的粗多糖；发酵液处理山药多糖组（CYF）：加入发酵护色液护色处理的山药中提取的粗多糖。实验组加入的山药多糖均直接溶解于含10%胎牛血清的DMEM 培养基后，过0.22 μm 的无菌滤膜并重复3 次。

1.3.9.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性

参照chen 等[14]的方法，采用CCK-8 法检测细胞增殖活性，其中细胞增殖率按下式计算：

式中：OD实验组为实验组在450 nm 波长下的OD值；OD空白对照组为空白对照组在450 nm 下的OD值。

1.3.9.3 细胞因子分泌水平测定

根据ELISA 试剂盒说明检测细胞培养基中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细胞白介素（interleukin，IL）-1β、细胞白介素（interleukin，IL）-6的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵液发酵时间对山药褐变及多糖含量的影响

发酵时间对山药褐变及多糖含量的影响如图1所示。

由图1可知，随着发酵时间的延长，山药多糖的含量呈现先上升后下降，而山药的相对褐变度呈现先下降后上升。其中当发酵时间为36 h，多糖含量最高为12.22%，此时山药的相对褐变度为51.43%。而在48 h时，相对褐变度则达到最低点为43.81%，此时山药多糖的含量为11.01%。综合考虑，选定36 h 为最佳发酵液发酵时间。

图1 发酵时间对山药褐变及多糖含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on polysaccharide yield and browning index

2.1.2 发酵液添加量对山药褐变度及多糖含量的影响发酵液添加量对山药褐变及多糖含量的影响如图2所示。

图2 发酵液添加量对山药褐变及多糖含量的影响Fig.2 Effect of the additive amount of color-protective agent on polysaccharide yield and browning index

由图2可知，随着发酵液添加量的增加，山药多糖得率增加，当发酵液添加量为10%后，多糖含量无明显变化。而山药的相对褐变度则随着发酵液添加量增加不断下降，直至发酵液添加量为10%后，再增加发酵液的添加量，山药的相对褐变度无显著变化。当发酵液添加量为10%时，山药多糖的得率为10.63%，而相对褐变度为46.95%。综合考虑，选定最佳发酵液添加量为10%。

产乳酸芽孢杆菌的主要发酵产物为乳酸，发酵液的添加量不同，护色液的酸度等均发生变化。因此，发酵液的添加量对山药多糖的得率和相对褐变度均有影响，在一定范围内，多糖得率和护色效果均随着发酵液添加量的增加而增加。这可能是因为酸性溶液能够降低多酚氧化酶的活性，同时也能够减少氧气在酸溶液中的溶解度，能够有效减缓酶促褐变，达到护色的效果[15]。同时，王宗军[16]认为，多糖结构中均含有不稳定的“H”，可能自身易被氧化，造成多糖的损失，而刘静等[17]的研究表明护色剂在一定程度上能够起到排氧的作用，能够抑制多糖被氧化，在一定程度上，发酵液添加量越大，说明其中包含的产乳酸芽孢杆菌的发酵产物越多，排氧程度越高，因此多糖得率越多。但是当发酵液添加量增大10%，再增大发酵液添加量对山药护色及对多糖含量的影响不显著。

2.1.3 护色时间对山药褐变度及多糖含量的影响

以添加10%的发酵时间为36 h 的发酵液制备得到护色液为护色剂，探究不同护色时间对山药多糖的得率与山药相对褐变度的影响如图3所示。

图3 护色时间对山药褐变及多糖含量的影响Fig.3 Effect of soaking time on polysaccharide yield and browning index

由图3可知，随着护色时间的延长，山药多糖得率先增加后减少，其中护色时间为1 h 时，山药多糖的得率最高，但当护色时间继续延长，其多糖含量变化不明显。而山药相对褐变度则随着护色时间的延长呈现先下降后上升，当护色时间为1 h 时，山药的相对褐变度最低，其后延长护色试验，山药的相对褐变度变化不明显。综合考虑，选定1 h 为最佳护色时间。

2.2 发酵护色液制备工艺条件的优化

在单因素试验的基础上，选用响应面分析法对发酵护色液制备工艺条件进行优化选取了不同的水平进行中心组合试验，其中发酵时间、发酵液添加量和护色时间为自变量，多糖得率和相对褐变度均为响应值，试验方案设计及结果见表2，多糖得率回归模型方差分析见表3，相对褐变度回归模型方差分析见表4。

运用Design Expert8.0 软件对表中的试验结果进行整理分析，回归拟合，得到的回归方程预测模型如下：

从表3可以看出，一次项中A（发酵时间）和B（发酵液添加量）对多糖得率的线性效应显著（P＜0.05），C（护色时间）对多糖得率的线性效应不显著（P＞0.05），二次项中，B2、C2影响均极显著（P＜0.01），AC影响显著（P＜0.05），AB、BC、A2影响不显著（P＞0.05）。此模型显著性检测P值小于0.000 1，极显著，失拟项P值为0.349 4，不显著。模型的相关系数为0.980 5，调整复相关指数为0.955 5。因此，说明模型的拟合程度好，试验误差小。根据F 值大小可知，在试验范围内各因素对多糖得率的影响因素大小依次为A（发酵时间）＞B（发酵液添加量）＞C（护色时间）。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Experimental design with experimental values of polysaccharide yied and browning index for response surface analysis

从表4可以看出，一次项中C（护色时间）对相对褐变度的线性效应极显著（P＜0.01），A（发酵时间）和B（发酵液添加量）对相对褐变度的线性效应显著（P＜0.05），二次项中，B2、C2、BC影响均极显著（P＜0.01），A2影响显著（P＜0.05），AB、AC影响不显著（P＞0.05）。此模型显著性检测P值小于0.000 1，极显著，失拟项P值为0.053 9，不显著。模型的相关系数为0.990 1，调整复相关指数为0.979 5。因此，说明模型的拟合程度好，试验误差小。根据F 值大小可知，在试验范围内各因素对多糖得率的影响因素大小依次为C（护色时间）＞A（发酵时间）＞B（发酵液添加量）。

通过回归模型分析可知，以多糖得率为指标，护色最佳工艺为，采用发酵时间为33.93 h 的产乳酸芽孢杆菌发酵液，发酵液添加量为12%，护色时间为0.94 h。在此条件下，模型预测山药多糖的得率为12.78%，相对褐变度为41.74%。考虑到在实际应用中操作简便，将工艺条件修正为采用发酵时间为34 h 的产乳酸芽孢杆菌发酵液、发酵液添加量为10%、护色时间为1 h；在此条件下，多糖得率为12.44%，相对褐变度为43.05%，实际值与理论值基本相符，说明模型对采用产乳酸芽孢杆菌配制护色液工艺条件参数优化可靠可行，具有一定的应用价值。

2.3 不同护色剂对山药PPO和POD活性的影响

不同护色剂对山药中PPO 和POD 的酶活性及护色效果的影响如图4所示。

表3 多糖得率回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model of polysaccharide yield

表4 相对褐变度回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model of browning index

图4 不同护色液对山药中的PPO 和POD 酶活性及山药褐变的影响Fig.4 Effect of different color protecting on PPO and POD activity and browning index

由图4可知，最优的发酵护色液和传统亚硫酸钠两种护色液均能够有效抑制PPO 和POD 活性。其中：发酵护色液对于PPO 的抑制效果显著优于亚硫酸钠护色液，而两种护色液护色后POD 活性没有显著差异（P＞0.05）。通过比较相对褐变度可知，亚硫酸钠护色液和发酵护色液均有明显的护色效果，其中发酵护色液的护色效果显著优于亚硫酸钠护色液。

果蔬的褐变从本质上可分为由于酚类物质在酶的作用下氧化成能聚合形成褐色物质的醌类的酶促褐变，以及其他非酶原因导致的非酶褐变两大类[18-19]。山药中的褐变以酶促褐变为主，赵喜亭等[20]研究表明，在山药中，褐变发生的位置与山药中的酚类物质的分布情况相同，其中PPO、POD 和苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的活性与山药的褐变度呈正相关，其相关性依次为PPO ＞POD ＞PAL，因此PPO 是使得山药褐变的主要因素[21-22]。根据Li 等[23]研究成果表明，产乳酸芽孢杆菌的产物中包含有乳酸，其生长稳定期为36 h～48 h，此时积累的发酵产物最多，而48 h 时后开始进入衰亡期，采用产乳酸芽孢杆菌发酵液制备护色液，可能是因为产乳酸芽孢杆菌生长过程中的乳酸等发酵产物能够有效的减缓山药中的酶促褐变，以此达到护色效果。因此在本试验中，可能由于发酵护色液对山药中的PPO 和POD 具有明显的抑制效果，发酵护色液能够起到明显的护色效果，其中PPO 与山药褐变的相关性大于POD，所以发酵护色液的护色效果优于亚硫酸钠护色液的护色效果。

2.4 不同护色剂对山药多糖免疫活性的影响

巨噬细胞能够分泌细胞因子参与调控天然免疫防御和特异性免疫，其在机体防御、自身稳定方面都发挥着重要的作用，如直接杀伤病原微生物、抑制肿瘤细胞生长，消除凋零细胞[24-25]。不同护色处理后的山药多糖对RAW264.7 细胞的增殖率的影响如图5所示。

由图5可知，CYH 在质量浓度为31.25 μg/mL～1 000.00 μg/mL 时，对细胞增殖率的影响与空白对照组相比无显著差异，说明CYH 在该浓度下对细胞无毒，但当质量浓度提高至2 000 μg/mL 时，细胞增殖率有明显的提高，与空白对照组相比存在显著差异（P＜0.05）。而CYN 在质量浓度为31.25 μg/mL～2 000.00 μg/mL 时，随着多糖浓度的增加，细胞的生长反而受到了抑制，Zhao 等[26]研究表明，硫处理会促进细胞凋亡，可能的原因是其增加了凋亡相关的基因和蛋白的表达，其中包括Bax and caspase-8。因此当多糖的质量浓度为1 000 μg/mL～2 000 μg/mL 时，CYN 显著抑制细胞的增殖。但CYF 未出现这个情况，相反，CYF 随多糖的质量浓度的增加，细胞增殖率增加。其中，多糖质量浓度为1 000 μg/mL 和2 000 μg/mL 时，CYF 对细胞增殖率显著高于CYN（P＜0.05），与CYH 的细胞增殖率相近，说明这可能是山药多糖本身促进细胞的增殖，而采用发酵护色液处理并未对多糖的细胞增殖促进作用产生影响。总体而言，不同护色处理的山药多糖对细胞增殖率的影响不同，在高浓度下（1 000 μg/mL～2 000 μg/mL）CYF 和CYH 均能显著提高细胞增殖率，但是CYN 则极显著抑制细胞增殖率，结果表明，经过亚硫酸钠处理的山药所得的山药多糖对细胞增殖具有抑制作用，但采用清水处理和采用发酵护色液处理的山药所提取得到的多糖则能对RAW264.7 的增殖有促进作用。不同护色处理的山药多糖对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的影响如图6所示。

图5 不同护色处理的山药多糖对RAW264.7 细胞增殖的影响Fig.5 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on the proliferation of RAW264.7

图6 不同护色处理的山药多糖对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的影响Fig.6 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on TNF-α secretion of RAW264.7

由图6可知，相对于空白对照组，加入质量浓度为31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 的3 种护色处理后的山药多糖均对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的水平有极显著影响（P＜0.01）。其中CYN 在31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 的质量浓度下，随之山药多糖的质量浓度的增加，RAW264.7 细胞分泌的TNF-α 的水平呈现先增加后降低的趋势，在250 μg/mL 时达到最大值。而CYF 和CYH 在质量浓度为31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 时，RAW264.7 细胞分泌的TNF-α 的水平随着山药多糖的质量浓度的增加而增加。通过对比可知，3 种处理后的山药多糖均能够提高细胞分泌TNF-α 的水平，但是CYN 在高浓度（500 μg/mL～2 000 μg/mL）下对提高RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的水平有所降低，但是仍然高于空白对照组，而CYF 和CYH 对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 水平存在浓度依赖性，而且两者对于分泌水平的影响相似。通过对比可知，CYN 和CYF 对于提高RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的水平具有显著差异，CYF 对于细胞分泌TNF-α 的提高显著优于CYN，这可能是因为硫处理减少粗多糖的免疫调节活性可能是与其下调MAPK 信号通路有关[26]。不同护色处理的山药多糖对RAW264.7 细胞分泌IL-1β 的影响见图7。

图7 不同护色处理的山药多糖对RAW264.7 细胞分泌IL-1β 的影响Fig.7 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on IL-1β secretion of RAW264.7

如图7所示，与空白对照组相比，3 种不同护色处理后的山药多糖对小鼠RAW264.7 细胞分泌IL-1β 均有促进作用。CYN 在1 000 μg/mL～2 000 μg/mL的质量浓度下，能够极显著提高IL-1β 的分泌水平（P＜0.01），但在小于1 000 μg/mL 的质量浓度下无显著影响；CYF 在62.5 μg/mL～250 μg/mL 的质量浓度下，能显著提高细胞分泌IL-1β 的水平（P＜0.05），在500 μg/mL～2 000 μg/mL 的质量浓度则有极显著的影响（P＜0.01）；CYH 在250 μg/mL～2 000 μg/mL 质量浓度下，能极显著提高细胞分泌IL-1β 的水平（P＜0.01）。而在本试验浓度下，CYF 对RAW264.7 细胞分泌IL-1β 水平的促进作用明显优于CYN。

3 结论

本文提供了一种优化后的山药的非硫护色方案，与采用亚硫酸盐护色方案相比，本护色方案能够有效抑制山药的褐变，显著降低山药中PPO 和POD 活性，同时提高多糖得率和保护山药多糖的活性，尤其与传统含硫护色相比，采用发酵护色液处理的山药中的山药多糖的活性显著优于采用亚硫酸钠处理的，对实际生产具有一定的参考价值。