于学平，匡炳霖，戴晓红，邹 伟△，滕 伟，于薇薇，马慧慧，陈秋欣，刘 鹏

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨第九中学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(ICH)指非外伤性脑实质出血[1]，具有发病率和死亡率高、预后差、并发症多等特点，是威胁人类生命健康和生活质量的重大疾病[2]，至今尚缺乏真正有效的治疗方法和药物。随着对脑出血后脑损伤机制研究的日益深入，ICH后神经干细胞(NSCs)大量坏死被认为是导致神经功能受损的主要因素，Wnt通路被证实是维持细胞增殖分化的主要通路之一，而通路中的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是抑制该通路的重要因子，其失活被认为是神经元存活机制之一[3]。当ICH发生后，GSK-3β对该通路的抑制作用被解除，激活的Wnt通路即可促进NSCs增殖分化[4]。针灸作为重要的治疗中风的手段已在世界范围内得到了广泛的关注和认可[5-6]。针刺在NSCs增殖分化方面起到积极作用，而这一疗法能否在ICH大鼠中通过抑制GSK-3β表达从而激活Wnt通路来促进NSCs增殖分化是本研究的目标。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

符合国家二级动物标准的健康清洁级Wistar雄性大鼠192只。由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。体质量(250±20)g，自由觅食饮水。实验前饲养(8±2)天，体质量符合(340±30)g的标准后入组，造模前12 h开始禁食，6 h前开始禁水。随机分为空白组(A组，n=12)、模型组(B组，n=60)、抑制剂DKK1组(C组，n=60)、针刺组(D组，n=60)。B、C、D组大鼠再按3、7、14、21、28天5个时间点随机分成5个亚组，每个亚组12只。

1.2 主要仪器与试剂

立体定位仪(成都仪器厂，STW-1);针灸针(华佗牌，0.35×40 mm);牙钻(上海齿科机械厂，307-6);一抗(Rabbit-anti-GSK3-β，北京博奥森);二抗(Goat-anti-Rabbit，北京博奥森);核酸扩增仪(ABI 9700，美国);凝胶成像系统(Alpha Innotech公司，美国);垂直电泳转膜系统(Bio Rad公司，美国)。

1.3 ICH模型制作

采用戊巴比妥(60 mg/kg) 腹腔注射麻醉。取俯卧位固定于立体定位仪上。矢状位切开头皮，暴露前囟。将微量注射器固定于立体定位仪上，对准前囟，向右旁开3.5 mm，再向后旁开0.2 mm，在此处做一标记，用牙钻钻孔，此处正对鼠脑基底节区。同时鼠尾取血，用微量注射器抽取60 μL自体血，在此孔于脑组织表面深6 mm的深度以20 μL/min速度缓慢注血，完毕后3～5 min出针。牙科水泥封闭钻孔，庆大霉素消毒，缝合伤口。采用Berderson评分法[7]对各组大鼠进行神经功能评分。将1～3分大鼠视为造模成功，纳入实验。

1.4 干预方法

空白组不作处理，直接取材。模型组造模后不作处理；抑制剂DKK1组造模前30 min注射GSK-3β抑制剂DKK1 10 μL(浓度0.1 μg/μL)；针刺组造模后，参照《实验动物穴位图谱》，选取百会穴和曲鬓穴，以0.35×40 mm针灸针快速刺入百会穴帽状腱膜下，并向右下方曲鬓穴透刺，进针深度大约15 mm。以200转/min速度进行捻转，每日1次，每次留针30 min，期间捻转刺激2次，每次持续5 min。不同组大鼠经相应处理后在各自时间点取材(A组不分时间点，直接取材)。

1.5 指标检测

1.5.1 神经系统功能评估 分别在造模后3、7、14、21、28天应用Longa评分[8]进行神经功能评估。

1.5.2 免疫印迹实验方法 先制备SDS-PAGE凝胶。取待测组织研磨，再加入蛋白裂解液，接着沸水煮样品5分，之后冰盒静置，12 000 r/min下4℃离心10 min，把上清液滴入离心管。测完蛋白含量，用进样器取样品上样。电泳、转膜、封闭。封闭液中加适当浓度一抗4℃过夜，第2天取出复温加适当浓度二抗。

1.5.3 PCR实验方法 离心管在冰浴中分别加入PCR缓冲液、dNTP、引物和DNA模板等。将混合液离心后放入PCR扩增仪内扩增。最后PCR电泳检测。

1.6 统计学分析

所有数据均用SPSS17统计软件进行分析。神经功能评分、免疫印迹和PCR结果应用单因素方差分析结合Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺治疗对脑出血大鼠神经功能影响

如表1所示，针刺组和抑制剂组从14天开始Longa评分显著降低，且针刺组与抑制剂组相比明显降低(P<0.05);针刺组与模型组相比从14天开始评分明显降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠神经行为学Longa评分比较

2.2 各组GSK-3β蛋白表达

空白组GSK-3β表达最高；模型组总体比空白组低，其中7天最低，而后逐渐升高；另两组GSK-3β表达在14天最低，而后逐渐上升。抑制剂组3、14、21、28天与同时间模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。针刺组14天与同时间模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注:M.模型组,D.抑制剂组,Z.针刺组;与M比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 各组GSK-3βmRNA PCR结果

GSK-3βmRNA空白组最高。模型组、抑制剂组和针刺组14天表达最低，而后总体呈上升趋势。抑制剂组3、7、21天与同时间模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。针刺组3、7、14天与同时间模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注:M.模型组,D.抑制剂组,Z.针刺组;与M比较,*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

“百会”透“曲鬓”针刺法是邹伟教授多年治疗脑出血的临床经验。“百会”透“曲鬓”可以贯穿督脉、足太阳膀胱经和足少阳胆经，具有统调一身之阳气的功能，并且可以达到一针横贯额、顶、颞3区的效果[9]，对ICH大鼠运动功能、感觉功能和意识的恢复方面均有很大帮助[10]。本研究中采取Longa神经功能评分法验证其改善脑出血大鼠神经功能缺损程度，结果显示,针刺组大鼠神经功能缺损降低，神经功能有明显恢复，与模型组比较针刺组疗效优于模型组。可见“百会”透“曲鬓”针刺法对脑出血大鼠的神经功能缺损具有明显的治疗作用。

近年研究发现，针刺在促进NSCs增殖分化方面有很大优势[11]，动物的大脑皮层分别与脑组织内不同神经功能分区相对应，针刺大脑皮层的不同神经功能区，就可刺激其对应脑组织NSCs的增殖分化[12]。GSK-3β是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶[13]。正常情况下，它在成体中枢神经系统内的神经细胞高表达，而且以Axin-Apc-GSK-3β复合物形式促进下游β-catenin磷酸化。β-catenin未被磷酸化时，可结合细胞核内的TCF/LEF，从而促进细胞增殖分化，但β-catenin被磷酸化后，这一过程即被终止。近些年研究发现,GSK-3β在调节Wnt通路方面发挥重要作用。Wnt因子是上世纪末在研究癌基因时首次发现的[14]，已经证实Wnt信号通路广泛参与多种血管疾病的发生[15]。当ICH等因素刺激下，Wnt基因大量编码Wnt蛋白并释放入细胞质，该蛋白首先会激活Dsh，激活的Dsh可抑制Axin-Apc-GSK-3β复合物形成，从而抑制β-catenin磷酸化[16]，继而促进NSCs增殖分化，因此形成Wnt-GSK-3β-β-catenin通路。但单纯在ICH应激下激活Wnt通路来促进NSCs增殖分化，其水平毕竟是有限的，如何更大程度激活Wnt通路从而促进NSCs增殖分化已成为研究热点。

从本实验结果可知，空白组GSK-3β表达最高；模型组总体比空白组低，其中7天最低，而后逐渐升高，针刺组和抑制剂组的GSK-3β表达在14天最低，而后逐渐上升。抑制剂组3、14、21、28天与同时间模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。针刺组14天与同时间模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。提示针刺可能通过抑制GSK-3β表达、激活Wnt通路的表达进而调节NSCs从增殖转入分化状态的细胞的数量和规模。

综上，我们推断针刺“百会”透“曲鬓”治疗脑出血可能的作用机制之一可能通过抑制GSK-3β表达来激活Wnt通路，继而促进NSCs增殖分化，从而促进ICH大鼠神经功能恢复。本研究证明,针刺可能以GSK-3β为靶点，促进神经干细胞的增殖分化，进而达到针刺治疗急性脑出血作用，进一步丰富了针刺治疗脑出血的作用机制。