刘 杨 李若瑜 刘晋芳 张冉冉 陈 浩 徐慧超 苗宇船

（山西中医药大学基础医学院病理教研室，山西 晋中 030619）

近年来，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率日益升高，全球患病率约为10%～30% （尤以经济发达区域为重），其中约10%～20%的患者已达到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的程度，如不及时治疗，10年内继发非酒精性脂肪性肝硬化（non-alcoholic fatty cirrhosis）或肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 的概率为 25%［1-2］。NASH不仅是人体代谢网络紊乱在肝脏集中体现，而且还与2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性代谢性疾病的发生发展密切相关［3-5］。前期研究发现，降脂平肝汤可通过减轻机体的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）从而发挥调节脂质代谢、防治NASH的作用，对改善NASH患者的临床症状具有良好的疗效［6-9］。但降脂平肝汤参与NASH的抑炎机制目前尚不清楚。本文拟通过观察降脂平肝汤对NASH大鼠肝脏TLR-4/TRIF炎性信号通路活性的影响，从而对降脂平肝汤的抑炎机制进行探讨，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本实验已获山西中医药大学实验动物伦理委员会批准。24只SPF雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，许可证号SCXK（京） 2014-0013，购自北京海淀兴旺实验动物养殖场。实验动物经1周适应性饲养后随机分为正常组、模型组和治疗组（n=10）。

1.1.2 药物与试剂 降脂平肝汤含丹参 30 g，泽泻 30 g，生山楂30 g，大黄10 g（药物购自北京同仁堂药业有限公司），常规制成水煎剂，并浓缩至每毫升含3 g生药。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和 Real-time PCR试剂盒购自 TaKaRa公司（D9108B、DRRO47A、DRR420A）；TLR-4 mRNA、TRIF mRNA和 β-actin mRNA引物 由TaKaRa公司合成，引物序列见表 1；RIPA组织细胞裂解液和 HRP-标记 IgG购自海斯信公司（PAB180006、PAB160013），BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司（P0010），TLR-4和 TRIF单克隆抗体购自 abcom公司（ab22048、ab13810），β-actin单克隆抗体购自 Santa cruz公司（sc-47778），ECL超敏发光液购自普利莱公司（P1010）；其他相关生化试剂或耗材均构自 Sigma或ZSGB-BIO公司。

表1 TLR-4 mRNA、TRIF mRNA和β-actin mRNA引物序列

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立 采用“高糖高脂饲料”饲养14周的方法，建立NASH大鼠模型。其中“高糖高脂饲料”的配制方法为基础大鼠饲料（68.6%）、猪油（20%）、蔗糖（10%）、胆固醇 （1%）、胆酸钠 （0.2%） 和丙硫氧嘧啶 （0.2%）［10］。

1.2.2 分组处理 大鼠随机分为正常组、模型组和治疗组（每组8只）。正常组大鼠常规饲料饲养，模型组和治疗组大鼠在建立NASH模型后，模型组大鼠给予生理盐水10 mL·kg-1·d-1灌胃；治疗组大鼠参照文献［7-8］的方法，给予降脂平肝汤水煎剂 10 mL·kg-1·d-1剂量灌胃（含 3 g生药/mL）。上述各实验组大鼠均在灌胃4周后处死，无菌、低温条件下提取肝脏组织，部分液氮保存，部分4%多聚甲醛固定。

1.2.3 察各实验组大鼠大鼠肝脏形态学改变 上述各实验组大鼠肝组织经4%多聚甲醛固定后，常规制作石蜡切片和进行HE染色。参照文献［10］的方法，计算炎症积分。

1.2.4 Real-Time PCR法检测TLR-4 mRNA和TRIF mRNA的含量 按RNA提取试剂盒说明书的方法提取各实验组大鼠肝组织中总RNA，并按反转录试剂盒说明书的要求进行反转录反应，反应条件：37℃×15 min，1次循环；85℃×5秒，1次循环。反转录产物 4℃保存。取 2 μL反转录产物与 Real-time PCR试剂盒相关试剂混合后（总体积为 20 μL） 进行 PCR扩增，反应条件：95°×30秒，1次循环；（95℃×5 sec，60℃×34 sec），40个循环。根据 Real-Time PCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对含量结果。

1.2.5 蛋白免疫印迹法 （Western-blot） 检测TLR-4和TRIF的表达量 取各实验组大鼠肝组织 1 g，与 1 mLRIPA组织细胞裂解液混合后，冰上研磨后消化5 min，4℃12 000 r离心10 min，上清液采用BCA法进行蛋白质定量（总蛋白浓度调整为1 g·L-1）。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质（电泳条件为10%浓缩胶80 V×40 min，4% 分离胶 120 V×50 min），湿转法转移蛋白质（条件为：90 V×30 min）。常规 5%脱脂奶粉室温封闭2 h，后分别加入 1∶1 000稀释的 TLR-4单抗、TRIF单抗及 βactin单抗 4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤 5 min×3次；1∶500稀释的HRP-IgG室温孵育 1 h，TBST缓冲液洗涤5 min×3次；加入ECL超敏发光液曝光，结果输入电脑后，采用IMS图象分析系统计算 TLR-4，TRIF与β-actin条带灰度值的比值，作为其各自的相对表达量。

1.2.6 统计学方法 所得计量数据均以（x±s）形式表示，并使用SPSS 13.0软件进行方差分析和SNK检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 降脂平肝汤对各实验组大鼠肝脏形态学的影响 与正常组比较，模型大鼠肝组织内可见肝细胞中度至重度水肿，胞质内出现大量脂肪空泡，肝小叶正常结构破坏，小叶内可见散在的点状坏死和炎细胞浸润，其炎性积分显著升高；与模型组比较，治疗组大鼠肝组织可见肝细胞脂肪变性程度明显减轻，细胞内仅可见少许小泡性脂肪滴，炎细胞浸润程度明显减轻，其炎性积分显著降低（结果见图1～2）。

图1 降脂平肝汤对各实验组大鼠肝细胞脂肪变性及炎性反应的影响（HE×200）

图2 降脂平肝汤对各实验组大鼠肝脏炎症积分的影响

2.2 降脂平肝汤对大鼠肝脏TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相对含量的影响 与正常组比较，模型组大鼠TLR-4 mRNA和 TRIF mRNA相对含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠肝脏内TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相对含量显著降低（P＜0.05） （结果见图3）。

图3 降脂平肝汤对各实验组大鼠TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相对含量的影响

2.3 降脂平肝汤对大鼠肝脏TLR-4和TRIF相对表达量的影响与正常组比较，模型组大鼠肝组织内TLR-4和TRIF的相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠肝组织内 TLR-4和 TRIF相对表达量显著降低（P＜0.05） （结果见图4～5）。

图4 各实验组大鼠肝脏TLR-4和TRIF蛋白的表达变化

图5 降脂平肝汤对各实验组大鼠TLR-4和TRIF相对表达量的影响

3 讨论

根据中医学的基础理论，NASH属“痰浊”“积聚”“湿阻”等范畴，临证多因饮食不节、劳逸无度、情志失调、久病体虚引起，导致肝失疏泄、脾失健运、湿邪内侵、痰浊内蕴、痰浊不化，湿、痰、瘀、积互结，痹阻于肝脏脉络而至发病［11-13］。因此，应以“疏肝健脾、化痰利湿、活血化瘀、通腑降浊”作为NASH基本治法。降脂平肝汤由大黄、丹参、泽泻、生山楂等药物组成，其中丹参、大黄具活血化瘀之功，泽泻有除湿消痰之效，而生山楂可祛瘀消积。诸药合方，可达“祛痰湿、化瘀积、调肝脾、通气血”之功效。本次实验结果显示，NASH大鼠经降脂平肝汤治疗 4周后，大鼠肝脏内脂肪变性及炎性反应程度显著降低，表明降脂平肝汤可有效抑制NASH大鼠肝脏内的炎性反应。

根据现代分子生物学理论分析，降脂平肝汤对NASH大鼠的抑炎机制可能与调节TLR-4/TRIF信号转导通路的活性有关。TLR-4属于Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs） 家族之一 （包括 TLR1～TLR11）［14-16］。TLRs识别内、外源性配体后，可以启动炎性应答信号通路、诱导炎性因子表达，从而对机体产生保护或损伤作用。TLR-4可通过介导髓样分化因子（myeloid differentiation primary response gene，MyD）-88依赖性信号转导通路和非MyD88依赖性信号转导通路（TLR-4/TRIF信号转导通路），激活核转录因子（nuclear transcription factor，NF） -κB［17-18］。

在正常状态下，NF-κB在细胞质内与IκB结合，构成非激活状态的复合物。而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等致炎因子可以通过激活TLR-4及其下游的MyD-88或 TRIF，引起 IκB的磷酸化和降解，从而使 NF-κB与IκB解离、活化，并向细胞核内转移，进一步介导大量炎性因子的合成与释放（见图6），从而导致包括NASH、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA） 等在内的多种慢性炎性疾病的发生、发展［19-23］。

本次实验结果显示，与正常组大鼠比较，NASH模型大鼠肝组织内TLR-4/TRIF信号转导通路的活性显著升高，表明 MyD88非依赖性转导途径的 TLR-4/TRIF信号转导通路是“高糖高脂饮食”所致肝脏炎性反应及肝组织损伤的分子生物学机制之一。而与 NASH模型比较，治疗组大鼠肝组织内TLR-4/TRIF信号转导通路的活性显著降低，表明降脂平肝汤的“祛痰湿、化瘀积、调肝脾、通气血”功效，可能就是与抑制 TLR-4/TRIF信号转导通路的活性，从而抑制肝组织内的炎性反应有关。

图6 TLR-4参与炎症的调控机制（引自Meng G，et al，2010）

降脂平肝汤调节TLR-4/TRIF信号转导通路活性的机制，我们分析认为可能与丹参以及大黄所含的大黄素有关。有研究发现，RAW 264.7细胞株经丹参乙醇提取物预处理后，TLR-4的表达明显受到抑制，同时细胞所产生的促炎因子显著降低（包括IL-1β、IL-6、TNF-α等），抗炎因子显著升高 （包括 IL-4、IL-10、TGF-β和IL-1Ra等），提示丹参可以通过抑制TLR-4的表达从而参与炎症的调控［24］。而Meng G等［25］研究发现，经 LPS诱导后，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 中 TLR-4的表达水平、IκB的降解水平以及NF-κB的活化水平均显示升高，同时促炎因子（包括IL-1β、IL-6）以及趋化因子（IL-8、CCL2）的含量显著增多；而经过大黄素预处理后，HUVECs中TLR-4的表达水平、IκB的降解水平以及NF-κB的活化水平均显示降低，同时促炎因子 （包括IL-1β、IL-6） 以及趋化因子 （IL-8、CCL2）的含量显著减少，并且上述效应呈大黄素浓度依赖性变化。上述研究均提示，大黄以及丹参可以通过调节TLR-4的表达，进而发挥抑制炎性反应的作用。因此，二者可能是降脂平肝汤抗炎机制的关键组分。但由于上述研究均为离体细胞研究，因此，丹参及大黄素的在体动物实验研究，将是我们今后研究降脂平肝汤抗炎机制的重点。

综上所述，TLR-4/TRIF炎性信号转导通路可能是降脂平肝汤治疗NASH的关键抗炎靶点之一，而大黄及丹参可能是降脂平肝汤抗炎机制中的关键组分。