李佳滨 薛钢 宁尚波 戴辛鹏 王晗

近些年来，随着医疗技术的快速发展，对心血管疾病治疗方法的研究也日渐深入。研究发现干细胞对修复损伤心肌细胞起到积极促进意义并逐渐成为潜在治疗方法[1]。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓内的成体干细胞，具备多种生物学特性，P17-BMP2 是BMP2 的核心功能区氨基酸序列合成的一条存在17 个核苷酸的寡肽BMP2，合成便捷，操作简单，具有调控成骨方向分化、骨诱导性的作用[2]。本研究据此探讨P17-BMP2 联合成骨诱导对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取3 周龄Wistar 雄性大鼠9 只（由上海第九人民医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK2012-0001），体质量60～70g；P17-BMP2 由清华大学合成提供；美国HyClone 公司生产的胰蛋白酶、DMEM-HG 及DMEM-LG 培养基；美国Gibca 生产的青霉素、特级胎牛血清、链霉素；美国Sigma 公司生产的β-甘油磷酸二钠、地塞米松、抗坏血酸；美国Invitrogen 公司生产的Trizol；日本同仁化学研究所生产的CCK-8 试剂；日本IX70 公司生产的荧光显微镜；美国DU-800 公司生产的核酸蛋白分析仪；美国MX3000P 公司生产的荧光定量PCR 分析仪；美国Beckman 公司生产的高速冰冻离心机。

1.2 培养方法将9 只大鼠脱颈处死，经75%乙醇浸泡消毒5min，无菌环境下，将双侧胫骨、股骨取出，剪除骨端，以止血钳压碎，取含有20%胎牛血清、100mg/ml 青霉素、100mg/ml 链霉素的DMEM 完全培养基，对骨髓腔进行冲洗，均匀分散骨髓细胞，使用吸管打匀，加入离心管，1 500r/min 离心5min，丢弃上清，适量DMEM 打匀，制作单细胞悬液，取1ml 悬液置入25ml 培养瓶内，放置37℃、5%CO2孵育箱内，48h 后换液，随后每72h 换液。待细胞汇合成80%～90%单层后，取0.25%胰蛋白酶消化进行传代，继续培养，取第3 代的细胞备用。随后分成两组进行培养，即A 组进行成骨诱导（含地塞米松7～10mg/L、维生素C 10mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L 的DMEM 培养基培养），B 组进行成骨诱导+P17-BMP2（成骨诱导液+P17-BMP2 10μg/ml培养）。

1.3 检测方法第3 代细胞，经BMSCs 离心稀释，吹打成浓度1×104cells/ml 的均匀单细胞悬液，接种在96 孔培养板，每孔置入100μl 细胞悬液量，设置3 个复孔、空白对照组（培养基100μl），孔板周围加PBS 100μl，保持湿度。接种4 个96 孔板，置入CO2孵育箱培养，24h 后换液，随后每72h 换液，在培养第1、3、5、7 天取出，每孔加10μl CCK-8 试剂，继续置入CO2孵育箱，孵育4h，酶联免疫测定法检测各组吸光光度值，取3 个孔的OD 平均值，波长450nm。取3 只大鼠骨髓，反复3 次。

取第3 代细胞，接种在24 孔培养板内，各组培养基培养7 天。PBS 洗涤，反复3 次，置入4℃固定液，流水冲洗后晾干。底物以二甲基甲酰胺溶解后，倒入缓冲液内，并加入固紫B 混匀；取工作液，置于37℃水温箱内，静置45min，流水冲洗；显微镜下观察；取3 只大鼠骨髓，反复3 次。

实时荧光定量PCR：按NCBI Cenebank 序列行引物设计，开盖前先进行离心，置入DEPC 处理的ddH2O 稀释，形成10nmol/μl 溶液，-20℃保存备用。OPN 引物序列：上游引物5'-CATCAGAGCCACGAG TTTCA-3'；下游引物5'-TCAGGGCCCAAAACACTA TC-3'；OCN引物序列：上游引物5'-TGCCTTCTGTCT GGGTGTCC-3'；下游引物5'-GCTGTGCCGTCCATACT TTCG-3'；Runx2引物序列：上游引物5'-CAACATCTCC ACATCATTAG-3'；下游引物5'-TTATTACCCTCTCA AACACTG-3'；β-Actin 引物序列：上游引物5'-TGG AATCCTG TGGCATCCATGAAACTA-3'；下游引物5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。在进行7、14 天培养后，收集细胞，使用Trizol 一步法，对细胞内总RNA 进行提取。每组设3 个复孔，采取Q-PCR 反复检测。取3 只大鼠骨髓，反复3 次。

1.4 观察指标①分析碱性磷酸酶活性检测值，碱性磷酸酶活性（金氏单位/100ml）=测定空OD 值/标准空OD 值×标准孔含酚量×2000 碱性磷酸酶的金氏单位；②荧光显微镜下观察细胞形态学特征；③分析培养细胞后细胞增殖、mRNA 表达。

1.5 统计学方法运用SPSS 20.0 统计学软件处理数据。计量资料以±s表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学特征在荧光显微镜下观察，大鼠BMSCs接种后，24h 即会贴壁，48h 后见细胞贴壁，外观呈纤维细胞样，接种3～7 天后，细胞对数生长，增殖显著，为单层生长。B 组大鼠在培养5～7 天后，细胞为椭圆形或多角形，为无规则堆积；细胞在融合生长期时，直径变短，形态呈扁平状，细胞核及细胞核仁清晰，见图1。

2.2 两组细胞增殖比较在培养细胞第1、3 天，A组、B 组BMSCs 细胞增殖程度比较差异无统计学意义（P＞0.05），培养第5、7 天后，B 组BMSCs 细胞增殖程度明显高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 原代培养5～7 天

2.3 两组mRNA 表达比较诱导第7、14 天，B 组OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表达均高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 两组碱性磷酸酶活性比较诱导第14 天，B 组碱性磷酸酶活性值为（1.32±0.10）U/L，高于A 组的（1.15±0.11）U/L，差异有统计学意义（t=3.431，P=0.002）。

表1 两组细胞增殖测定OD 值比较

表2 OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表达

3 讨论

骨髓间充质干细胞生物特性较多，如可促进血管生成，抑制细胞凋亡及免疫特性，并有抗纤维化、抗炎作用；同时骨髓间充质干细胞存在多向分化能力，比如转化为心肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型；另外骨髓间充质干细胞具有高增殖活性作用，成为理想的骨组织种子细胞[3]。

BMP2 是骨形态发生蛋白之一，属于TGF-β超家族中的一员，与其他骨形态发生蛋白相比，对成骨诱导活性的强度最高，可高度促进骨形成及表达，并能促使特异性骨细胞产物的分泌、生 成[4]。BMP2 信号传导途径是利用Smads 或MAPK两条途径，促进转录因子Runx2 及Osx，进而促进成骨细胞特异性的基因表达。在成骨过程中，通过BMP2 刺激，使BMSCs 出现趋向、聚集、分化作用，以此形成软骨及成骨。纯天然BMP2 组成有114个氨基酸，但只有20 多个氨基酸真正发挥出骨诱导作用，组成核心结构。尤其是在实际临床操作中，难以获得纯天然BMP2，操作复杂，获取困难，因此临床加大了对基因重组BMP2 的研究。P17-BMP2 是由17 个氨基酸组成的寡肽BMP2，活性特点明显，合成简单，通过细胞通讯及信息传递，可调控细胞成骨定向分化，具有骨诱导性；同时P17-BMP2 可使用多肽合成仪，在短期内大量制备小分子多肽，可减轻基因工程技术操作复杂程度，价格成本低；另外小分子多肽结构简单，可充分暴露活性位点，并轻易结合细胞受体，形成不同剂型的多肽，具有较高的生物活性与稳定性。因此P17-BMP2 操作简单，活性明显，具有较高的临床使用价值。

OPN、OCN 等是促进骨形成的特异性骨细胞产物，BMP-2 信号可激活转录因子Runx2 及Osx，以此激活成骨细胞特异性基因表达。碱性磷酸酶广泛存在于人体的肝脏、骨骼、肠等组织，属一组同工酶，主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断。本组实验发现，培养第5、7 天后，B 组BMSCs细胞增殖程度明显高于A 组，诱导第7、14 天，B 组OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表达均高于A 组，诱导第14 天，B 组碱性磷酸酶活性均高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究提示，P17-BMP2 联合成骨诱导有着促使骨生成，诱导成骨转为软骨的作用，诱发骨诱导活性。

为了实现体外组织工程骨体内植入实验的要求，需密切监测组织相容性，骨体植入的功能状态、愈合能力、再塑能力，观察移植物的生物学功能、血管化程度等。为了确保异体植入物的准确结果，需先排除正位植入物因受体骨、骨膜成骨导致的假阳性。P17-BMP2 与成骨诱导能够促使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，且P17-BMP2 与BMP2 相比，半衰期长，生物相容性高，适度降解性高，不影响BMP2 活性作用。

综上所述，P17-BMP2 联合成骨诱导能够促进骨髓间充质干细胞增殖以及成骨分化，P17-BMP2和成骨诱导剂联合作用在各个时间点均能促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖，对骨髓间充质干细胞的促分化作用明显，具有较高的可研究性。