赵艳雪，闫朝丽

（内蒙古医科大学附属医院内分泌科，内蒙古 呼和浩特 010059）

蛋白质组学（proteome）现已得到大家广泛认可并应用在动物血清、细胞及组织中，可鉴定出大量蛋白质。该技术主要通过双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）及质谱法（mass spectrometry,MS）的方法可发现大量差异蛋白具有共同的生理病理作用，可作为相关联的一组蛋白群整体研究[1]。目前对糖尿病背后的基因、蛋白变化等具体发病机制仍未明确，自从有研究者[2]通过该技术定量并鉴定到糖尿病患者及对照组的组织、细胞或细胞器中存在差异蛋白的表达，蛋白质组学技术就越来越受到广泛关注。

1 蛋白质组学发展过程

蛋白质组学的研究对象是蛋白质组，蛋白质组的概念首次由wlkins和williamstochu提出，当时定义为由一个基因组编码的全部蛋白质[3]。随后有学者对此定义进行了完善，即在细胞中由基因组表达的及表达后修饰的所有相关蛋白质。随着科学不断发展，目前认为蛋白质组是一个包含生物体所能表达全部蛋白质的领域，且存在时间和空间上动态变化。简而言之，蛋白质组学就是通过整体、动态、定量的方法对蛋白质组成的研究，并由此进一步获得对疾病发生、发展等机制的具体过程。

目前血清蛋白质组学方面的研究得到普遍应用，首先在血清中寻找出差异蛋白质位点，然后从差异蛋白中鉴定与疾病相关的血清蛋白质，通过生物信息学处理后研究差异蛋白的结构和功能。从蛋白质组学的角度来看，2型糖尿病是一种多种病理生理机制共同作用的疾病，会有多种异常蛋白的表达。因此通过蛋白质组学的方法分析2型糖尿病组织和血清的蛋白质表达谱变化，为2型糖尿病的发病机制、早期诊断的相关特异性标志物和药物靶点治疗等方面开辟新方法[4,5]。

2 蛋白质组学的主要方法学

2.1 双向凝胶电泳（two dimensional electrophoresis,2-DE） 2-DE的技术路线最早由Smithies等[6]提出，后来O’Farrell等学者[7]对此做了进一步的优化，使双向凝胶电泳分辨率得到了提高。双向电泳的原理主要是以胶条和SDS聚丙烯酰胺凝胶为介质根据蛋白质PH和蛋白质分子量大小不同进行电泳分离，分为称为等电聚焦分离（IEF）和SDS聚丙烯酰胺凝胶，两者分离方法后后会在SDS聚丙烯酰胺凝胶上留下位点，从而把复杂的蛋白混合物根据PH和分子量不同在二维平面上分布，最后用硝酸银或考马斯亮蓝进行染色，得到蛋白质表达谱。

2.2 质谱技术（biological mass spectrometry,BMS） 质谱技术基本原理是通过质谱分析仪以离子源、质量分析器和离子检测器为核心检测出离子的质量与电荷比大小来分析鉴定未知的蛋白质。传统的质谱技术仅可用于分析小分子物质，但随着离子技术经过不断升级改良，对于生物大分子物质特别是蛋白质类的分析也成为现实。目前改良的技术主要为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDITOF-MS）技术、表面增强激光解析电离（SELDI time-offlight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术以及液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandemmasss pectrometry,LC-MS-MS）等技术。这些技术的改良成为蛋白质组学的支撑技术，最主要的是应用更为广泛、方便、精确且重复率得以保证[8]。（1）基质辅助激光解析/电离飞行时问质谱（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）：MALDI-TOF-MS技术原理是将微量蛋白质与过量的小分子的混合液体点到样品靶上后先将样品离子化，然后再使用基质与激光直接照射离子化样品与之结合成结晶薄膜，最后用高电压使待测的样品经过电离过程后得到肽质量指纹谱（PMF）的方法。最终质谱分析所得肽质量指纹谱与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽段进行比较，从而对所测蛋白质进行鉴定。它具有准确性好、灵敏度高、重复性及高通量性等特点[9]，在2型糖尿病发病机制方面有很多重要研究成果应用涉及该技术，如有国内学者[10]应用MALDI-TOF-MS法检测视黄醇结合蛋白4基因多态性与2型糖尿病的相关性发现RBP4基因多态性位rS17484721AA基因型携带者增加胰岛素抵抗的风险。（2）表面增强激光解析电离（SELDI-TOF-MS）：SELDI-TOFMS技术是一种软电离生物质谱，其原理为设置好离子装置中的飞行时间后，使用脉冲氮激光能量直接照射在固相吸附蛋白质芯片的表面，将获取的样品蛋白从芯片表面中电离出来，最后根据样品蛋白电离飞行时间测量计算出样品蛋白的电荷和质量。利用这种技术可对待测样品进行直接检测，具有高灵敏度、技术难度低、高通量性等特点，相关研究更证明此技术适用于临床筛选新的疾病标志物、早期诊断和预后评估提供了可能[11,12]。黄波等[13]利用此项技术结和生物信息学建立了敏感性和特异性均较高的T2DM肾病诊断模型，为糖尿病肾病的诊断作出了贡献。（3）液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandem masss pectrometry,LC-MS-MS）：该技术是一种具有高灵敏度、高准确度以及分离范围广的快速分离方法，且能将的对未知化合物的结构破环性小，对应的标准样品要求比较低。液相的色谱和质谱联用技术的结合可将离子化水平发挥更为极致，能够使通过色谱纯化后的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次成谱被记录下来。从而可直接获得待测样品蛋白的相关结构信息。然后利用混合编程扫描，进一步获的待测蛋白的相关信息。有学者用LC-MS-MS技术研究2型糖尿病患者血清氨基酸水平与胰岛素抵抗时与临床资料结合分析后得出血清氨基酸水平在糖尿病患者中具有显著的差异，且相关氨基酸表达水平与糖脂代谢状况密切相关[14]。

2.3 生物信息学（biological information） 生物信息学的主要内容是对蛋白质组学数据库检索，数据库通过连接数学、计算机以及统计学等学科衍生而来各种方法获得生物大分子相关的信息[15]。具体包括为进行蛋白注释、差异表达蛋白的功能分类、亚细胞结构定位及功能富集聚类分析等内容。简单来说，蛋白质组学的生物信息学就是将质谱后得到的谱图数据进行分析处理后将网上现有的生物基因蛋白数据库进行比对分析，即可得到待测样品差异蛋白的相关信息。

3 蛋白质组学在2型糖尿病中的研究进展

2型糖尿病是一种在遗传、环境等因素刺激下导致高糖毒性、胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱等多种危害机体慢性代谢性疾病。目前已成为人类健康杀手最主要的慢性疾病之一。但是糖尿病患病人数仍在全球范围持续增长，据统计，2017年全球糖尿病的患病人数已高达4.25亿，预计2015年将达到6.29亿[16]。目前蛋白质组学技术在新发2型糖尿病领域主要研究内容为：①新发2型糖尿病标记物的筛选鉴定及早期筛查；②探索2型糖尿病发病机制及与环境的发生发展关系；③寻找新的治疗靶点、疗效评估及预后判断等研究，现就蛋白质组学在新发2型糖尿病研究中的基础及临床做一叙述。

3.1 蛋白质组学在2型糖尿病发病机制的研究 有学者[17]运用蛋白质组学方法揭示了2型糖尿病发病的可能机制，具体为机体接受多种发病信号后蛋白质的二级结构域和翻译后修饰发生多态性改变引起。Ahmed团队[18]于2005年首次描绘出了人胰岛素的蛋白质图谱，为糖尿病是胰岛功能方面的研究提供了便利，图谱共有700多个蛋白被检测到，且具有很高的重复性。同时还发现与糖尿病的疾病发展有关的差异蛋白表达如热休克蛋白、膜联蛋白等差异蛋白。Rutter等学者[19]通过蛋白质组学对健康和疾病中胰岛素的差异的研究中发现在mRNA和蛋白水平中某些关键因子表达变化可能是导致胰岛功能分泌缺陷的原因。研究表明胰腺癌也许会导致糖尿病的发生。Basso等[20]在胰腺癌相关糖尿病的蛋白质组学研究中发现了胰腺癌相关糖尿病的致病因子S-100钙结合蛋白，并且此蛋白与肿瘤相关的蛋白具有同源性。

3.2 蛋白质组学与2型糖尿病并发症的研究 目前关于蛋白质组学在2糖尿病并发症领域研究多为糖尿病肾病和视网膜病变的研究。研究已发现糖尿病肾病的发病机制及早期标记物取得一些成就，在一项用尿蛋白组学预测糖尿病肾病的实验中通过比较正常人和高发人群的尿蛋白检测出700多个尿蛋白峰后得出蛋白峰中存在很好的预见性，即可以较好的预见糖尿病肾病的发生趋势，为糖尿病肾病患者早期诊断提供线索，优于尿微量白蛋白2型对糖尿病早期肾病的诊断[21]。

糖尿病视网膜病变是糖尿病微血管病变最常见的并发症，是目前中老年人导致失明的主要原因。它的发病机制不仅只与体内糖脂代谢相关，原因是许多血糖控制较好的患者仍可发生，且视网膜病变的病理变化与免疫、炎症等反应密切相关。有学者在双向电泳在视网膜蛋白研究中，通过对比正常大鼠和糖尿病SD大鼠的视网膜组织差异蛋白表达情况得出两者之间的确存在差异，观察到糖尿病大鼠视网膜组织蛋白发生了改变，为差异蛋白的鉴定和功能分析提供重要基础[22]。Takahashi等[23]应用iTRAQ技术在研究小鼠2型糖尿病的相关血清蛋白中发现视网膜微血管内皮细胞渗透性的改变可能与人类的同系物SERPINA3有关，这可能是糖尿病视网膜病变的发病机制。所以，上述这些差异蛋白的检出及鉴定，可以为糖尿病视网膜病变的发病机制的了解提供了很好的线索。

蛋白质组学技术作为研究2型糖尿病及其并发症一种重要桥梁，它不仅提高了人们对此疾病从宏观表型到微观蛋白质组更为深刻的认识作用，还提供了新的方式使我们更加了解该病的发病机制是多种因素共同作用的结果，且遗传、环境、免疫因素相互作用，十分复杂。但可以通过鉴定疾病相关的的分子标志物，为早期诊断、寻找新的药物靶点等方面提供新的途径[24]。

4 蛋白质组学研究存在的问题以及展望

虽然蛋白质组学的方法研究对2型糖尿病分子水平上的研究具有推动作用，但该技术仍存一些技术局限性、血清蛋白未能有效提取、重复性不理想、研究耗时长、费用昂贵等诸多问题需要完善和解决。

首先排除高丰度蛋白质对低丰度蛋白质的掩饰是血清样品预处理的关键所在。血清标本的特殊性会对结果产生干扰，主要原因为血清中与疾病发生发展的关键的低丰度的蛋白可被存在的80%左右的高丰度蛋白质（包括白蛋白、IgG等）产生干扰，妨碍有效差异蛋白的检出。除此之外，双向电泳中的凝胶由于自身存在局限性，所以很难将血清中浓度范围较大蛋白全面地展示出来。其次该研究技术中的分离技术和图谱鉴定的对于具有极酸性、极低拷贝的蛋白上的应用存在困难。此外，建立一个可反映系统性变化中的蛋白质系统很难实现，主要是由于蛋白组学技术本身重复性有限难以统一动态变化的蛋白差异结果所致。最后，在探索2型糖尿病发病机制及与环境的发生发展关系过程中，蛋白质组学技术存在即使有相同的研究目的，但不同的研究人员结论也有可能偏差的问题，主要与待测样品及研究技术不统一相关，如样本获取途径、保存方式以及蛋白质芯片不同，所以解决这些问题的关键就是要对研究技术进行进一步的提高[25]。