白 松 吴 斌

中国医科大学附属盛京医院 泌尿外科（辽宁沈阳 110004）

前 言

囊性纤维化跨膜转导子基因 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR，OMIM602421，基因突变可以导致先天性双侧输精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens，CBAVD，OMIM 277180）的发生，在白种人中78%的CBAVD 患者至少有一种CFTR 基因变异类型， 其中46%同时存在两种变异类型。 白种人中约98%～99%的CBAVD 患者同时合并囊性纤维化（cystic fibrosis,CF,OMIM219700），而我国绝大部分为单独发病，不合并囊性纤维化。

CFTR 基因突变会导致细胞膜氯离子通道功能障碍，无法调节氯离子和水分子的流通，由此导致生殖道产生的黏稠状分泌物无法排除， 在胚胎期间即会导致输精管梗阻和变性，由此可能导致CBAVD 的发生[1]。

关于我国CBAVD 患者CFTR 基因变异的研究非常有限，已有的研究表明，在黄种人群中外显子突变率较低，且绝大多数突变频率小于0.1%，分布也与白种人完全不同[2]。 这说明CFTR 基因外显子突变具有明显的种族特异性，而且其非编码区可能存在导致CBAVD 疾病发生的变异，而这些变异类型不会导致CF 的发生。

短串联序列广泛的分布于基因组非编码区， 其重复片段的长短与疾病的发生密切相关。 同样在CFTR基因非编码区内， 存在大量的二聚体和四聚体短串联序列， 其通过与启动子相互作用调节转录而影响基因的表达。 (TAAA)n 微卫星片段是位于内含子10-11 中的由4 个碱基组成的重复序列， 虽然不像内含子9-10中的Tn 那样会影响第10 号外显子mRNA 的剪接，造成第10 外显子被漏转录，但是Estelle 等[3]的研究表明：IVS10-11(TAAA)n 短串联序列可以与FOXI1 转录因子结合，负向调节CFTR 基因的表达，当其重复数量减少时与FOXI1 转录因子结合力增加， 从而影响CFTR 基因的转录。 尤其当其与启动子c.-165G＞A 的轻微突变或与IVS9-10 （TG）mTn 相组合时， 可以导致CBAVD的发生， 是非常重要的顺式作用原件，IVS10-11(TAAA)n 短串联序列及其与启动子c.-165G＞A 变异的情况在中国人群中未见相关研究。 本研究旨在探索中国CBAVD 患者CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n 及启动子c.-165G＞A 的分布情况及其意义。

材料与方法

一、标本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在本院就诊的66 名CBAVD 患者为实验组及60 名因女方因素于我院行辅助生殖的健康男性为对照组； 本实验经过本院伦理委员会批准，所有入组患者均签署知情同意书。

CBAVD 患者纳入标准[4]：（1）两名专科医师同时查体，触诊双侧精索未触及输精管，睾丸大小正常（Prader 睾丸模型＞12mL）；（2）无囊性纤维化其他症状，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；（3）精液分析检查至少3 次，无精子，射精后尿液沉淀后也未见精子（除外逆行射精）， 精液量＜1.5mL，pH＜6.4， 精浆果糖＜13umol/mL 和ɑ-糖苷酶＜20μmol/mL；（4）超声提示附睾头饱满，呈网格状，可以伴有附睾尾以及精囊萎缩或缺如；（5）性激素水平正常；（6）染色体正常；（7）经皮睾丸穿刺取出精子行ICSI 辅助生殖；（8）无明确家族遗传疾病。

生育力正常男性对照组纳入标准：（1） 女方因素行ART；（2）精液分析正常；（3）性激素正常；（4）染色体正常。

二、外周血样本采集和DNA 提取

抽取外周血4～6mL，EDTA 抗凝后，-20℃保存。 采用AxyPrep 全血基因组DNA 提取试剂盒 （Axygen 公司，美国）提取DNA，DNA 试剂盒成分包括：BufferAP1（细胞裂解液）30mL，BufferAP2 （蛋白沉淀液）6 mL，Buffer W1A concentrate （洗涤液）24mL，Buffer W2 concentrate（去盐液）24mL，Buffer TE（洗脱液）11mL。 DNA提取操作步骤： 加500μLBuffer AP1 细胞裂解液到1.5mL 离心管中； 加200μLEDTA 抗凝全血到Buffer AP1 中，涡旋振荡10s；加100μLBuffer AP2 蛋白沉淀液涡旋振荡10s，然后12 000×g离心10min；将制备管放入2mL 离心管中，将上述离心后的上清加入制备管中，然后12 000×g离心10min；弃滤液，加入700μL Buffer W1A concentrate 洗涤液，室温放置2min，然后12 000×g离心30s；弃滤液，加入800uL Buffer W2 concentrate 去盐液，室温放置2min，然后12 000×g离心1min；弃滤液，将制备管至于新的1.5mL 离心管中，在中央悬滴加100μl Buffer TE 洗脱液，室温放置1min，然后12,000×g离心1min，离心管内即为DNA；使用UV 紫外分光光度计检测标本浓度及纯度，OD260nm/OD280nm 位于1.8～2.0 之间，否则重新提取，最后-80℃保存。

三、CFTR 基因内含子10-11 (TAAA)n 荧光FAM标记引物，PCR 扩增及PCR 产物毛细管电泳法检测STR 分子标记

根据Ensembl 网站的CFTR 基因序列(http://asia.ensembl.org/index.html) 使用Primer 5.0 软件设计引物，由ncbi-blast 验证特异性， 委托北京博奥生物有限公司合成引物， 引物信息为正链(5'to3')GGAGGCTGAGGCAGGAGAA， 反链(5'to3')AGAAAAGCTGAAAGTCAAAAGG，5’ 端-FAM 标记，PCR 产物大小约360bp左右。

PCR 反应体系： 共计25μl， 包括水19.8μl，Taq Buffer 2.5μl，dNTP 10mM 0.5μl， 引物f 0.5μl， 引物R 0.5μl，Taq 酶5U/μl 0.2μl，模板1μl。 PCR 反应条件：预变性95℃3min，变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，循环数30 循环，修复延伸72℃6min。 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测，随机挑4 个样本PCR 产物检测，确定扩增产物 （2%琼脂糖凝胶电泳， 参数设置150V，100mA，20min）。

荧光标记的PCR 产物检测：取96 孔反应板，标明板名、实验日期，制作电子版检测表，并自动生成上机表；使用连续加样器，吸取990μl HIDI 和10μl LIZ500的混合物，加入到96 孔反应板中，每孔10μl；将96 孔板置于平板离心机中，离心500g 即停；使用12 排10μl排枪，对照检测表，在96 孔板对应的孔中加入50pg 的样品；将96 孔板置于平板离心机中，离心500×g即停；使用封板膜密封96 孔板，振荡，将96 孔板置于平板离心机中， 离心500×g即停， 置于PCR 仪； 变性程序为98℃5min，程序结束后立即将96 孔板置于冰水混合物上急速冷却，再置于平板离心机中，离心2000×g即停；使用ABI 3730xl 测序仪检测STR 样本。 选取标准样本，根据测序结果对样本定标，使用Genemapper 软件分析STR 数据，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值，根据片段大小来判断结果。

四、CFTR 基因ATG 转录起始前1.4kb 启动子测序

根据Ensembl 数据库CFTR 基因启动子序列（http://asia.ensembl.org/index.html）， 使用primer premiere 5.0设计引物，ncbi-blast 验证特异性， 由TaKaRa Biotechnology(大连，中国)合成，PCR 引物序列5'-TCACAAGACCCTTGCCTTAG-3' (forward) and 5'-GCCTTTTCC AGAGGCGACCT-3' (reverse). 扩增产物片段大小为1402 bp，使用1%琼脂糖凝胶（TaKaRa 公司，日本）电泳确认该引物合成DNA 片段的特异性。

PCR 试剂（TaKaRa 公司，日本），总反应体系20μl，包括DNA 样品0.5μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，2.5mmol dNTP Mix 1.6μl，Primer 10.8μL，Primer 20.8μL，5u Ex Taq 0.2μL，ddH2O 14.1μL。

PCR 反应条件：初始变性95℃，5 分钟；变性95℃，30s； 退火58℃,30s； 延伸72℃，40s； 终末延伸72℃，10min； 共计30 个PCR 循环。 纯化扩增产物后使用ABI 7500 Sequence Detection System 测序仪测序。

五、生物学信息来源和分析软件

基因组数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen ome/guide/human；http://www.ensembl.org； 引物设计软件：Primer 5.0；基因比对：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat；基因序列分析软件：Chromas1.6。

六、数据统计分析

使用SPSS22.0 软件进行统计学分析， 计数资料使用χ2检验，Fisher's exact test 和非条件logistic 回归，P＜0.05 认为有意义。

结 果

一、CFTR IVS10-11(TAAA)n，荧光FAM 标记引物PCR 毛细管电泳法检测结果

在CBAVD 患者中IVS10-11(TAAA)n基因型分布有6 种，分别为(TAAA)9/(TAAA)9、(TAAA)9/(TAAA)10、

(TAAA)9/ (TAAA)11、 (TAAA)9/ (TAAA)12、 (TAAA)10/(TAAA)10和(TAAA)10/(TAAA)11，分别所占的百分比为：21.21%、50.00%、9.09%、3.03%、12.12%和4.55%；以(TAAA)9/(TAAA)10基因型为主（50.00%）；正常人群则仅有(TAAA)9/(TAAA)9和(TAAA)9/(TAAA)10两种基因型，分别所占的百分比为：78.33%和21.67%，以(TAAA)9/(TAAA)9为主(78.33%)，这与CBAVD 组明显不同。 两组之间有显著的统计学差异（Fisher's exact test=45.903，P＜0.01），见图1，表1。

CBAVD 组等位基因可见4 种类型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和 (TAAA)12， 所 占 比 例 分 别 为52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。 正常人群的对照组仅可见2 种等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分别为89.17%和10.83%， 两组之间有显著统计学差异（X2=60.589，P＜0.01），见图1、表2。

表1 CFTR IVS10-11(TAAA)n 基因型分布情况

表2 CFTR IVS10-11(TAAA)n 等位基因型分布情况

二、IVS10-11(TAAA)n 基因型的相对危险度

非条件Logistics 回归分析结果表明：(TAAA)9/(TAAA)10基因型患 CBAVD 的风险是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.228 倍，见表3。

表3 CFTR IVS-9(TAAA)n 基因型的相对危险度

三、启动子c.-165G＞A 变异结果

66 名CBAVD 患者均未发现CFTR 基因启动子c.-165G＞A 变异，见图2。

图2 CFTR 基因c.-165G＞A 变异情况a:CFTR 基因启动子1.4kb PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果；b:CFTR 基因c.-165G＞A 正常纯合型

讨 论

1989 年Riordan 等[5]首先克隆了CFTR 基因（OMIM 602421） 的cDNA 片段并鉴定了其产物CFTR 蛋白（OMIM 602421），该基因位于7q31.2，包含约250kb[6]。CFTR 基因有高度多态性，目前NCBI 公布的CFTR 基因有2009 种突变形式，绝大部分发生率低于0.01%，极少数变异类型超过1%[7]。 目前研究显示78%的CBAVD 患者至少有一种CFTR 基因变异类型， 其中48%同时存在两种变异类型， 大部分为温和的点突变（IV/V 级），很少有基因缺失或重排出现，约＜1%[8]。 其突变频率及热点，因地域和种族不同而有差别很大，白种人CFTR 基因突变率明显高于黄种人。

囊性纤维化（CF）在白种人中发病率约为1/2500，大约1/25 的人群为突变基因的携带者， 而在黄种人中CF 非常罕见， 发病率小于0.1/10 万，CF 的男性患者中95%～99%存在CBAVD[9]，而在我国，绝大部分仅存在CBAVD， 不合并囊性纤维化。 白种人和黄种人的CBAVD 发病率相似，约为1/1000，是常染色体隐性遗传疾病。 目前认为CBAVD 为囊性纤维化的一个轻度的临床表现类型，定义为囊性纤维化相关疾病，可以单独发病，也可以同时合并囊性纤维化[10]。 一般认为一个严重杂合突变联合一个轻微杂合突变（88%）或者两个轻微的杂合突变（12%）会导致CBAVD 的发生，而一个严重的纯合突变（88%）或两个严重的杂合突变（12%）会导致CF 的发生[11]。

白种人CBAVD 患者最常见的等位突变基因为p.F508del、IVS9-10 5T 和p.R117H， 出现的频率分别为21%～33%、25%～44%和3%[12,13]最常见的基因型为p.F508del/IVS9-10 5T 和p.F508del/p.R117H，频率分别为28%和6%[4]。我国关于CBAVD 患者CFTR 基因突变的研究有限，外显子突变率低约12.7%～37.0%，而且绝大多数突变频率小于1%，分布也与白种人完全不同[2]。 这表明导致CBAVD 的CFTR 基因突变位点可能位于非编码区。

短串联序列广泛的分布于基因组非编码区，其重复片段的长短与疾病的发生密切相关，如II 型肌萎缩[18]及男性女乳[19]，既往的研究也证实位于启动子及内含子[20,21]中的微卫星片段能够影响基因转录。 同样在CFTR 基因非编码区内， 存在大量的二聚体和四聚体短串联序列， 其通过与启动子相互作用调节转录而影响基因的表达。 (TAAA)n微卫星片段是位于CFTR 基因内含子10～11 中的由4 个碱基组成的重复序列，虽然不像内含子9～10 中的Tn 那样会影响第10 号外显子mRNA 的剪接，造成第10 外显子被漏转录，但是Estelle 等[3]的研究表明：FOXI1 转录因子可以与IVS10-11 (TAAA)n短串联序列结合，负向调节CFTR 基因的表达，当其重复数量减少时与FOXI1 转录因子结合力增加， 从而影响CFTR 基因的转录。 原因可能为改变DNA 结构来影响其转录效率， 比如通过使DNA 结构弯曲或呈环状后，会易化顺式作用原件和反式作用因子之间的作用，尤其与c.-165G＞A 同时存在，致病风险更加增大。 FOXI1转录因子是由FOX 基因（winged helix/forkhead box）编码的一组核蛋白，通过与DNA 内高度保守的forkhead顺式作用元件结合， 广泛参与组织和器官的分化和形成， 其具有明显的组织特异性[22]。 最近的研究表明，FOXI1 对生精功能有重要作用，Blomqvist[23]将小鼠的FOXI1 基因敲除后，发现小鼠无法繁殖，另有研究也发现其对附睾成熟也具有重要作用[24]。

国外研究显示正常白种人(TAAA)n 以9 为主，CF患者以11 为主， 并且一般与p.F508del 突变连锁，CBAVD 患者也以9 为主，偶见6 和8[25,3]，目前没有我国CBAVD 患者和正常人群的相关资料， 本研究结果表明我国人群与白种人不同，CBAVD 组等位基因可见4 种类型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12，所占比例分别为52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。正常人群仅可见2 种等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分别为89.17%和10.83%，CBAVD 患者等位基因(TAAA)9频率明显低于正常人群， 两组之间有显著统计学差异（P＜0.01）。

我国CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10为主约占50.00%，(TAAA)9/(TAAA)9仅占21.21%；正常人群基因型则以(TAAA)9/(TAAA)9为主，约占78.33%，两组之间有显著的统计学差异（P＜0.01）；另外3 种等位基因型(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12均只出现在CBAVD 患者中，同时在我国CBAVD 患者和正常人群中均未见到(TAAA)6或(TAAA)8的等位基因类型。根据logistic 回归分析我们发现(TAAA)9/(TAAA)10基因型患CBAVD 的风险是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.22倍，如果出现(TAAA)10、(TAAA)11或(TAAA)12则患病风险会更高。这表明我国人群的CFTR 基因内含子10～11(TAAA)n分布完全不同于白种人， 而是有明显的种族特异性， 随着重复次数的增多，CBAVD 发病风险显著升高。

另外Estelle 等[3]认为(TAAA)n与启动子c.-165G＞A 突变有协同作用， 会引起CFTR 基因转录水平下降， 导致疾病发生。 而根据启动子测序结果显示我国CBAVD 患者中均未发现此种突变，说明我国CBAVD患者(TAAA)n变异与此启动子突变无协同作用。

CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n的多态性与白种人不同， 我国CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10为主，正常人群基因型则以(TAAA)9/(TAAA)9为主。 同时也未发现IVS10-11(TAAA)n与启动子c.-165G＞A 突变有协同作用。