谢冬琳 戴婷 黄丽 麦一峰 蒋峻 谢燕青 何文明

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种与血脂异常及血管壁成分改变有关的动脉疾病，主要累及大中型动脉，其共同特点是动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小[1]。临床试验证实，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在动脉粥样硬化性心血管疾病的发病中起着重要作用。近几年研究发现，血管紧张素 -（1-7）[angiotensin-（1-7），Ang-（1-7）]在减少平滑肌细胞增殖和迁移、改善内皮功能、调节脂质代谢等方面发挥了重要作用，可以抑制动脉粥样硬化病变和增加斑块的稳定性[2]；而血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）可以通过水解血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ） 生成 Ang-（1-7）。所以，ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴有可能成为动脉粥样硬化新的治疗靶点。

血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（angiotensin receptor blocker，ARB）类药物为目前广泛应用于临床的RAS阻滞剂；而LCZ696[3，4]是首个血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制剂，可在抑制有害的肾素-血管紧张素-醛固酮系统的同时增强心脏保护性神经内分泌系统。利钠肽（natriuretic peptide，NP）是维持体内水钠平衡的一个重要神经内分泌多肽家族，具有排钠利尿、舒张血管、抗增殖的作用，还可以抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统[5]。本研究拟通过动物实验比较不同RAS阻滞剂及LCZ696对动脉粥样硬化小鼠ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴的影响，并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性ApoE-/-小鼠28只，C57BL/6小鼠7只，6周龄，购于北京维通利华公司。

1.1.2 药物与试剂 高脂饲料（18.4%脂肪）购于北京博泰宏达公司，生产批号2017072304，规格2kg；依那普利购自江苏制药股份有限公司，生产批号17091111，规格5mg；缬沙坦购自北京诺华公司，生产批号H20040217，规格80mg；LCZ696购自瑞士诺华公司，生产批号TN026，规格50mg；ELISA Kit购自上海桥杜生物公司，生产批号20180106，规格96次；TRIzol试剂购自美国ambion公司，生产批号140501，规格100ml；HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物公司，生产批号50231，规格 100rxns；Fs essential DNA green Marker购自美国罗氏公司，生产批号31498300，规格10ml；引物购自深圳华大基因，β-actin的Primer ID：180507_003A06，ACE2 的 Primer ID：171204_012G07；ACE2兔单克隆抗体购自美国abcam公司，生产批号 GR145000-19，规格 100μl；Ang-（1-7）兔多克隆抗体购自美国ImmunoClone公司，生产批号P2018041609，规格100μl；免疫组化试剂盒购自北京索拉宝公司，生产批号20180620，规格1kit。

1.1.3 主要仪器 全自动生化分析仪：深圳库贝尔公司；酶标仪：美国Thermo公司；倒置显微镜：Nikon仪器（上海）有限公司；超微量紫外分光光度计：香港基因有限公司；PCR仪：德国eppendorf公司；荧光定量PCR仪：美国Roche LightCycler 480Ⅱ。

1.1.4 动脉粥样硬化模型构建、分组及给药 将ApoE-/-小鼠高脂喂养14周建模后按随机数字表分为4组，每组7只，分别予以0.9%氯化钠溶液（ApoE-/-对照组）、依那普利（8mg/kg，依那普利组）、缬沙坦 （30mg/kg，缬沙坦组）、LCZ696（60mg/kg，LCZ696组）灌胃处理，C57BL/6组小鼠予以等量0.9%氯化钠溶液。干预6周后处死以上5组小鼠，取血样及病理标本。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平测定 小鼠眼眶静脉取血后，常温静置 30min，离心（3000r/min，10min），取上清，用全自动生化分析仪检测血脂水平。

1.2.2 血清CRP、IL-6水平测定 取小鼠血清，按CRP （Mouse CRP ELISA Kit）、IL-6[Mouse IL-6 ELISA Kit]酶联免疫试剂盒说明书步骤进行CRP、IL-6水平测定。

1.2.3 血清ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平测定 取小鼠血清，按ACE2（Mouse ACE2 ELISA Kit）、Ang- （1-7）[Mouse Ang- （1-7）ELISA Kit]、AngⅡ[Mouse AngⅡ ELISA Kit]酶联免疫试剂盒说明书步骤进行 ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平测定。

1.2.4 判断建模是否成功 取整根主动脉，沿内圈剖开，油红O工作液染10min，70%酒精分化，蒸馏水冲洗，铺平拍照。

1.2.5 斑块脂质含量测定 制作冰冻切片：取小鼠主动脉根部，多聚甲醛固定1h、20%蔗糖溶液过夜、30%蔗糖溶液过夜、O.C.T.包埋后切片备用。冰冻切片油红O染色：先用PBS洗涤5min，60%异丙醇浸润，油红O染10min，60%异丙醇终止反应，苏木素复染3min，自来水返蓝，干燥，甘油封片，拍照，用Image J分析图片阳性面积。

1.2.6 主动脉ACE2mRNA表达的检测 （1）用TRIzol试剂从主动脉组织中提取总RNA，用超微量紫外分光光度计测RNA浓度并确定逆转录时需要加入的RNA量；（2）按HiFiScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒说明书步骤加样，在PCR仪中合成cDNA；（3）取 cDNAⅡ1μl，在荧光定量 PCR 仪中进行PCR反应，并与内参照（β-actin）同时扩增。引物序列分别为：ACE2上游引物：5'-TGGTCTTCTGCCATCCGATT-3'，下游引物：5'-CCATCCACCTCCAC TTCTCTAA-3'；β-actin 上游引物：5'-TATTGGCAA CGAGCGGTTC-3'，下游引物：5'-ATGCCACAGGATT CCATACCC-3'。建立20μl的扩增反应体系，依次加入：RNase-Free Water 7μl，Fs essential DNA green Marker（10μl，cDNA1μl，上游引物 1μl，下游引物1μl。反应条件：94℃预变性 5min；PCR 循环 95℃10s，56℃20s，72℃30s；最后 72℃延伸 1min。扩增 45个循环。结果采用2-△△CT法进行分析。

1.2.7 主动脉斑块中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达的检测 取小鼠主动脉弓制作冰冻切片后按免疫组化试剂盒检测ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达，拍照，用Image J分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件。多个样本均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血脂水平测定 与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组LDL-C、TC水平显著升高且差异有统计学意义（P＜0.01）；ApoE-/-对照组、依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组LDL-C、TC水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1。

图 1 各组血脂水平比较（A：LDL-C，B：TC；与 C57BL/6 组相比，*P＜0.01）

2.2 各组血清CRP、IL-6水平 与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组血清CRP、IL-6水平显著升高（均P＜0.01）；与ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组血清CRP、IL-6水平显著降低（均P＜0.01），见图 2。

2.3 各组血清ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平 与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组血清 ACE2、Ang-（1-7）水平显著降低（P＜0.01），AngⅡ水平显著升高（P＜0.01）；与 ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组血清ACE2及Ang-（1-7）水平显著升高（P＜0.01），AngⅡ水平显著降低且差异有统计学意义（P＜0.01），见图 3。

图2 各组血清CRP、IL-6水平比较（与C57BL/6组相比，#P＜0.01；与ApoE-/-对照组相比，*P＜0.01）

图 3 各组血清 ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平比较（与 C57BL/6 组相比，#P＜0.01；与 ApoE-/-对照组相比，*P＜0.01）

2.4 各组主动脉大体油红O染色 肉眼可见，与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组斑块明显增多，说明AS建模成功；与ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组斑块均有减少，其中以LCZ696组减少最为显著，见插页图4。

2.5 各组主动脉根部冰冻切片油红O染色 肉眼可见，与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组斑块明显增多；与ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组斑块均有减少，其中以LCZ696组减少最为明显（插页图5）。与C57BL/6组相比，ApoE-/-对照组斑块阳性面积显著增加（P＜0.01）；与ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组斑块阳性面积显著减少（P＜0.01）；与依那普利组、缬沙坦组相比，LCZ696组斑块减少更明显，且差异有统计学意义（P＜0.05），见图 6。

2.6 各组主动脉ACE2 mRNA的表达 与ApoE-/-对照组相比，依那普利组ACE2 mRNA的表达水平明显升高（P＜0.01），LCZ696组ACE2 mRNA的表达水平升高且差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

图6 各组主动脉根部斑块脂质含量（与C57BL/6组相比，#P＜0.01；与ApoE-/-对照组相比，*P＜0.01；与依那普利组、缬沙坦组相比，△P＜0.05）

2.7 各组主动脉斑块ACE2和Ang-（1-7）蛋白的表达 与ApoE-/-对照组相比，依那普利组、缬沙坦组和LCZ696组主动脉斑块中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与依那普利组、缬沙坦组相比，LCZ696组主动脉斑块中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达增加更明显且差异有统计学意义（P＜0.01 或 0.05）（见图 8、插页图 9）。

3 讨论

图7 各组主动脉ACE2 mRNA的表达（与ApoE-/-对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01）

动脉粥样硬化促进了心脑血管疾病的发生，是一种炎症、血栓、多种细胞类型相互作用的复杂病理过程。RAS具有重要生理功能，同时RAS的异常激活及其介导的炎症、氧化应激和内皮功能紊乱参与了AS的发生、发展过程[6]。近年来发现的RAS家族新成员Ang-（1-7），让人们对RAS在AS进程中的作用有了更加完整的认识。Ang-（1-7）的生物学效应主要通过G蛋白偶联受体Mas介导，其可抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，改善内皮细胞功能，调节脂质代谢，从而达到延缓AS进程，增加斑块稳定性的作用[7-8]。因此，作为传统 RAS的重要补充，ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴可延缓 AS 的进展，具有重要的心血管保护效应[2，9]。

图8 各组主动脉斑块ACE2（A）、Ang-（1-7）（B）蛋白的表达（与ApoE-/-对照组相比，*P＜0.01；与依那普利组相比，#P＜0.01；与缬沙坦组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01）

本研究中依那普利、缬沙坦、LCZ696对血脂（LDL-C和TC）的影响与ApoE-/-对照组相比差异无统计学意义，提示其并非通过降低血脂来发挥抗动脉粥样硬化作用。ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴具有抗增殖、减少氧化应激及炎症作用。众多研究表明[10-11]，通过阻断RAS的不同环节，可提高ACE2、Ang-（1-7）浓度及表达，进而起到抗动脉粥样硬化作用。国内学者Zhang等[12]发现氯沙坦可增加血管平滑肌细胞中ACE2的浓度、抑制动脉粥样硬化斑块的形成，进而提示有抗动脉粥样硬化作用。本课题组近期研究也证实，卡托普利和氯沙坦的干预下自发性高血压大鼠平滑肌细胞中的Ang-（1-7）浓度增加[13]。本研究发现依那普利组和缬沙坦组血清中的ACE2和Ang-（1-7）浓度升高、AngⅡ浓度降低、炎症因子CRP、IL-6水平显著降低、主动脉斑块中的ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达增加、主动脉脂质斑块含量亦减少；且依那普利还可以增加主动脉ACE2 mRNA的表达。提示循环及局部的ACE2和Ang-（1-7）在抑制AS形成发展中起重要作用。而且依那普利和缬沙坦可通过作用不同的RAS环节，提高循环ACE2和Ang-（1-7）浓度、降低AngⅡ浓度、增加主动脉ACE2和Ang-（1-7）蛋白及分子的表达、降低炎症因子水平，进而起到抗动脉粥样硬化作用。

LCZ696是一种新型血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制剂，因其能改善心力衰竭患者的预后，临床上用于治疗射血分数降低的心力衰竭[14]。本研究发现与ApoE-/-对照组相比，LCZ696组主动脉脂质斑块明显减少，血清ACE2和Ang-（1-7）浓度升高，AngⅡ浓度降低，炎症因子CRP、IL-6水平显著降低，主动脉ACE2 mRNA的表达增加，主动脉斑块中的ACE2和Ang-（1-7）蛋白表达增加。提示LCZ696 可以通过 ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴起到抗动脉粥样硬化作用。此外，我们还发现与缬沙坦组相比，LCZ696组主动脉脂质斑块面积减少更明显。推测与LCZ696中的脑啡肽酶抑制剂有关。据报道[15]，长期使用脑啡肽酶抑制剂可减少动脉粥样硬化的形成，保护内皮依赖性血管舒张，以及增强脑钠肽的内皮舒张作用，并抑制促动脉粥样硬化的内皮素。此外，脑啡肽酶抑制剂可以降低心房利钠肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）在内的利钠肽的降解。ANP具有抗动脉粥样硬化的特性，有研究发现[15]在体外培养的人动脉内皮细胞中，ANP可以防止血栓介导的内皮细胞通透性增加，这可能减少脂质蛋白等大分子穿过内皮屏障，从而减少斑块形成。最后应该指出的是，我们的目标不是单独评价ARB或脑啡肽酶抑制剂的个体贡献，而是评估两者联合使用是否有更好的抗动脉粥样硬化作用。本研究结果与先前的药动学研究[16]一致，证实两者发挥药效方面有协同作用，在抗动脉粥样硬化上比单用ARB效果更显著。

综上所述，依那普利、缬沙坦和LCZ696均可通过ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴抑制动脉粥样硬化的发展，且LCZ696抗动脉粥样硬化作用更明显。