（湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南长沙410007）

低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1～7个半乳糖基，即Gal-（Gal）n-Glc/Cal（n为0～6）[1-2]。GOS少量存在于动物乳汁中，而在人体母乳中较为丰富，可以有效促进婴儿体内双歧杆菌群的增殖，还具有防止骨质减少、改善脂质代谢、改善矿物质元素吸收、预防治疗便秘、改善营养状况、增强免疫力等营养功能[3]。

目前，GOS的安全性已经被广泛认可，成为食品及乳制品领域研究热点[4-6]。中华人民共和国卫生部公告2008年第20号已批准GOS为新资源食品，可以在婴幼儿乳制品及食品中添加，食用量≤15 g/d[4]。目前，低聚半乳糖作为重要益生元，在市面很多奶粉中均有添加，含量从几百到几千毫克每百克不等。

低聚半乳糖是由一系列半乳糖基低聚糖组成的混合物，聚合度从2至8不等，目前可以分离并确定结构的低聚半乳糖组分已达15种[7]。鉴于结构复杂性，以现有技术无法制备所有结构组分的标准品，用于每种低聚半乳糖的定量。目前，有关低聚半乳糖的分析研究多采用酶解法，研究对象主要集中于转化酶产物、糖浆、米粉样品及液态奶等[8-15]乳糖含量低的样品。如杨晓波等[8]对婴幼儿米粉中低聚半乳糖的测定进行了研究；张志国等[11]采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定液态奶中低聚半乳糖含量，但液相色谱-蒸发光散射方法存在分离效果差、检测灵敏度低的缺点；郑惠玲等[12]阐述了离子色谱法测定低聚半乳糖原料中乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖的含量，对方法回收率及检出限进行了探讨。

因为基于美国AOAC 45.4.12-2001.02《选定食品产品中反式低聚半乳糖的测定》方法[15]的酶解法，定量依据是酶解试样中半乳糖的增量，所以待测试样中乳糖含量是影响定量检测结果准确性的最主要因素（该标准已进行相关说明）。已有相关文献报道[8]，当样品中乳糖量低于低聚半乳糖量的3倍时，酶解法才能有较好的精密度及回收率。婴幼儿配方奶粉中乳糖含量一般在50 g/100 g左右，通常GOS添加量小于5 g/100 g，由GOS酶解得到的半乳糖较由乳糖酶解得到的半乳糖低很多，可忽略为从仪器分析及样品前处理所产生的误差，因此该方法不能直接准确检测婴幼儿奶粉中低聚半乳糖的含量。

本研究首先是采用酶解法，对婴幼儿配方奶粉同批次GOS原料进行前处理分析，采用灵敏度高的离子色谱-电化学脉冲安培检测器测定原料中GOS含量（GOS原料通常含有乳糖、葡萄糖、半乳糖等其他成分），再依据原料和婴幼儿配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，选择一组GOS特征峰，以该同批次原料糖浆作为对照品，间接测定婴幼儿配方奶粉中GOS含量。该方法为婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖的检测提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

ICS-3000离子色谱仪（AS-DV自动进样器、四元梯度泵、电化学脉冲安培检测器，变色龙6.8色谱工作站）：赛默飞世尔科技公司；SHZ-W恒温振荡器：常州万顺仪器制造有限公司；SI-234电子天平：美国丹佛仪器公司；Milli-Q超纯水仪：德国默克密理博公司；BXM-30R高压灭菌锅：上海博讯公司；TD-6高速离心机：万和仪器制造公司；VGT超声波清洗机：广东固特公司。

1.1.2 试剂

标准品D-葡萄糖（纯度99.5%）、D-果糖（纯度99.6%）、半乳糖（纯度 99.9%）、蔗糖（纯度 99.5%）：德国 Dr.Ehrenstorfer；β-半 乳 糖 苷 酶 （240 U/mg）：Megazyme公司；乙腈（色谱纯）、无水乙酸钠（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、三水磷酸氢二钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团；50%氢氧化钠（色谱纯）：戴安公司；C18 固相萃取小柱（500 mg；3 mL）：艾杰尔公司；低聚半乳糖糖浆原料、同批次奶粉、低聚半乳糖奶粉空白：奶粉企业提供。

1.1.3 试剂配制

磷酸盐缓冲溶液（20 mmol/L，pH 6.0）：准确称取6.0 g三水磷酸氢二钾和22.0 g磷酸二氢钾，溶解稀释至1 L，高压灭菌器中120℃灭菌30 min，备用。

β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：取 240 U/mg的半乳糖苷酶，用磷酸缓冲溶液配成2 000 U/mL的溶液，冷冻保存。

乙酸锌溶液（300 mg/mL）：称取30.0 g乙酸锌，水溶解定容至100 mL。

亚铁氰化钾溶液（150 mg/mL）：称取15.0 g亚铁氰化钾，水溶解定容至100 mL。

盐酸溶液（2.5 mg/mL）：量取22.5 mL，水稀释定容至100 mL。

氢氧化钠溶液（2.5 mg/mL）：称取10 g氢氧化钠，加50 mL水溶解，冷却后定容至100 mL。

氢氧化钠溶液（200 mmol/L）：取10.4 mL 50%氢氧化钠溶液，用水稀释到1 000 mL，通入氮气保护，缓慢混匀，室温下可放置7 d。

氢氧化钠（150 mmol/L）和乙酸钠（500 mmol/L）混合溶液：称取41 g无水乙酸钠（精确至0.01 g），用500 mL水溶解，0.45 μm滤膜过滤，脱气，加入7.8 mL 50%氢氧化钠溶液，并用水稀释至1 000 mL，通入氮气保护，缓慢摇匀，室温下可放置7 d。

1.1.4 标准溶液的配制

称取适量乳糖、葡萄糖和半乳糖标准品，配制成含量分别均为1.0 mg/mL的储备液。分别吸取适量储备液，用水稀释定容至100 mL，配成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL工作液，离子色谱仪进行测定分析。以乳糖、葡萄糖和半乳糖峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2 试验方法

1.2.1 原料糖浆分析

称取原料糖浆试样约0.1 g，加入40 mL加热至60℃的磷酸盐缓冲液，超声10 min，混匀溶解，转移并定容至100 mL，为试样液。取25 mL容量瓶，加入1 mL磷酸盐缓冲液和1 mL β-半乳糖苷酶溶液，置于100℃水浴加热20 min，使酶失活，冷却室温后准确加入2.5 mL试样液，标记为酶解样A。另取25 mL容量瓶，加入1 mL磷酸盐缓冲液和1 mLβ-半乳糖苷酶溶液，准确加入试样液2.5 mL，标记为酶解样B。A、B同时置于60℃水浴振荡酶解60 min，冷却后纯水定容至25 mL，混匀。取上清液过C18固相萃取小柱及0.22 μm滤膜，采用离子色谱法测定原料样中低聚半乳糖含量。酶解样A测定游离乳糖、葡萄糖和半乳糖含量，酶解样B测定葡萄糖和半乳糖总含量。原料样中低聚半乳糖含量结果按以下公式计算[12-15]。

式中：GB为经β-半乳糖苷酶酶解反应后半乳糖总含量，%；GA为样品中游离的半乳糖含量，%；GL为样品中乳糖水解产生的半乳糖含量，为样品中游离乳糖含量除1.9[12]，%；k为半乳糖转换为低聚半乳糖的转换系数，无量纲。

式中：n为低聚半乳糖平均聚合度。

1.2.2 奶粉样品前处理优化

对婴幼儿奶粉中蛋白质的去除，进行方法学考察，分别是乙腈沉淀蛋白、调pH值沉淀蛋白、沉淀试剂（乙酸锌和亚铁氰化钾溶液）沉淀蛋白，分别在1.0、2.0、4.0 g/100 g 3个水平进行加标回收试验。

1.2.3 奶粉成品分析

称取0.5 g婴幼儿配方奶粉样品（精确至0.1 mg），加入4 mL热水（约60℃）溶解，超声提取20 min，乙腈定容至10 mL，混匀，3 000 r/min离5 min，取上清液1.0 mL，用水稀释至10 mL，过C18净化小柱及0.22 μm滤膜后，进行离子色谱分析。

以糖浆原料为对照品，配制成GOS浓度为25.0、50.0、100、250、500 μg/mL 的对照品工作液，通过比较原料对照品、同批次GOS奶粉样品及GOS空白奶粉样品图谱，选取1组某聚合度的GOS特征峰，依据原料和同批次婴幼儿配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，采用外标法定量计算产品中低聚半乳糖总含量。

1.2.4 色谱条件

色谱柱 CarboPacPA20离子色谱柱（3mm×150mm，6.5 μm）；柱温 30 ℃；进样量 10 μL；流速 0.45 mL/min：电化学-脉冲安培检测器，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极，检测池温度30℃，检测波型（standrad quad）。考虑到试验操作的便捷性，避免频繁更换流动相，造成试剂浪费，本次研究参照低聚果糖国家标准GB 5009.255-2016《食品安全国家标准食品中果聚糖的测定》，选用氢氧化钠溶液（200 mmol/L）、氢氧化钠（150 mmol/L）乙酸钠（500 mmol/L）混合溶液、水作为流动相，并对色谱条件进行了优化，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2 结果与讨论

2.1 原料的GOS测定结果

采用离子色谱-电化学脉冲安培检测器测定混合标样、酶解液（A）、酶解液（B），经分析发现半乳糖、乳糖及葡萄糖得到很好分离。分析色谱图如图1～图3。

由于不同工艺生产出的低聚半乳糖产品在结构比例上存在一定差异，导致不同类型产品的平均聚合度n不同，从而影响系数k值大小。利用色谱双柱法对GOS含量在30%～60%的样品进行分析检测[16]，可知低聚半乳糖平均聚合度为2.16，得经验换算系数k为1.36。

绘制半乳糖和乳糖的标准工作曲线，可得出半乳糖线性方程为：y=0.098 65x-0.426 3，R2=0.998 8；乳糖的线性方程为：y=0.093 17x-0.312 6，R2=0.999 1。通过测定酶解样A中游离乳糖、葡萄糖和半乳糖含量，酶解样B中葡萄糖和半乳糖总含量，按公式（1）计算GOS含量，结果如下表2所示，测定结果平均值为56.1 g/100 g（理论值为57%），RSD为0.64%。

图1 混合标样色谱图Fig.1 Chromatogram of mix standards

图2 酶解液A色谱图Fig.2 Chromatogram of enzymatic hydrolysate A

图3 酶解液B色谱图Fig.3 Chromatogram of enzymatic hydrolysate B

表2 GOS组分测定结果（n=3）Table 2 Composition of GOS samples（n=3）

2.2 奶粉样品前处理优化结果

3种蛋白沉淀加标回收率比较见表3，3种蛋白沉淀加标回收率比较图见图4。

调pH值沉淀和加沉淀试剂色谱峰形不佳，同时回收率也稍低，故选择乙腈作为蛋白沉淀剂。由于低聚半乳糖属于可溶性膳食纤维，高比例乙腈会造成低聚半乳糖萃取效果差、回收率低；如乙腈含量低于50%，蛋白质沉淀效果不佳，故选择60%乙腈沉淀蛋白。

2.3 特征峰的选择

以由酶解法测得GOS含量的初始原料作为对照密度较好，RSD为3.5%。品，对奶粉成品中GOS进行定量分析，特征峰的选择至关重要，通过对原料对照品、空白样品、待测奶粉样品色谱图分析，发现有多组峰可作为参考选择，本次研究发现，选择以11 min附近的色谱峰作为特征峰，可得到较准确的定量结果，故作为本次研究的特征峰。原料对照品、空白样品、待测样品色谱图分析结果如图5。

表3 3种蛋白沉淀加标回收率比较Table 3 Recovery rates of three precipitation methods

图4 3种蛋白沉淀加标回收率比较图Table 4 Recovery rates of three precipitation methods

2.4 标准曲线及线性方程

以已知含量的原料作为对照品，配制系列浓度的低聚半乳糖工作液，不同浓度工作液色谱图如图6，通过浓度对特征峰面积的线性拟合，得出GOS线性方程为：y=0.082 5x-0.527 2，R2=0.999 7。

2.5 精密度试验

按上述样品分析步骤，对含GOS奶粉样品平行测定6次，计算相对标准偏差RSD，结果见表4。由表可知，以原料作为对照品测定奶粉中GOS含量，方法精

图5 色谱对照图Fig.5 Chromatogram comparison

图6 原料对照品系列浓度色谱叠加图Fig.6 Chromatogram of series raw material

2.6 加标回收试验

加标回收选取3个加标水平对GOS空白奶粉样品进行加标回收试验，加标量分别为1.0、2.0、4.0 g/100 g，按前述样品处理步骤进行处理，每个加标水平平行测定3次，试验结果见表5。根据结果可知，加标回收率为87.7%～92.4%，结果表明，此方法准确度较高。

2.7 方法检出限

为考察方法检出限，本试验在低水平对GOS空白样品进行加标测试，加标量为0.25 g/100 g。以低聚半乳糖目标峰附近13 min～16 min为噪声计算范围，试验结果见如下表6。

根据GB 5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》附录A.2，色谱仪检出限为最低响应值（S）对应的检出浓度或检出量，其中S=3N（N为仪器噪声水平）。由表6可知，在该水平加标信噪比S/N为3.2～4.1，满足要求。本次验证选择加标量0.25 g/100作为方法检出限。

表4 精密度试验结果Table 4 Results of precision experiment

表5 加标回收率试验结果（n＝3）Table 5 Results of recovery rate（n=3）

表6 检出限试验结果Table 6 Results of detection limit test

3 结论

本次试验通过采用离子色谱-脉冲安培法，首先检测低聚半乳糖原料中低聚半乳糖纯度，再使用同批次低聚半乳糖原料作为分析对照品，外标法测定婴幼儿奶粉中低聚半乳糖的含量。试验结果表明，该方法精密度较好，原料分析RSD 0.64%，成品分析RSD 3.5%，加标回收率87.7%～92.4%。此方法降低了成本，对检测婴幼儿配方奶粉中的低聚半乳糖，具有较高的准确度和灵敏度，为乳糖含量高的产品中GOS检测方法研究提供一种新思路。