（嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴314050）

近年来，以门店形式现制现售的食品越来越受到年轻人的喜爱，包括外卖、饮料、甜品等。但是，由于现制食品涉及到的原料新鲜度、保存条件及现场制作的环境、保藏条件、保存时间及人员操作等均对最终产品具有潜在的病原微生物污染风险。该类食品现制现售、流通较快，对微生物检验数据出具的时间要求较为紧迫。目前，对于食品中微生物检测主要采用GB 4789系列标准，而且我国尚未对现制现售食品发布相关检验标准，采用传统微生物检测方法，步骤涉及分离、纯化、生化鉴定等，方法上显得冗长，时间上显得滞后，不利于安全监管，也不利于应对大型集会及突发性食品安全事件。

目前，检测微生物的方法主要有常规培养法、核酸探针法、聚合酶链反应法（polymerase chain reaction，PCR）、酶联免疫分析法、单克隆抗体检测技术、免疫磁珠富集技术、快速测试片法、免疫磁球法、基因芯片法等[1-2]，而其中的PCR技术在微生物检测方面近年来得到广泛应用，这使得病原微生物的快速检测得以实现。

研究人员利用PCR技术进行单重病原微生物检测，如用PCR扩增沙门氏菌的hilA基因快速检测沙门氏菌[3]；用PCR技术能检测牡蛎中1 CFU/g～10 CFU/g的沙门氏菌[4]、鸡皮中自带空肠弯曲菌[5]检测、通过扩增金黄色葡萄球菌的nuc基因，可以从牛奶中检测出金葡菌[6]、采用环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法检测大肠杆菌 O157：H7[7]等。利用多重PCR技术的检测也有广泛应用，利用基因芯片实现肉中常见食源性致病菌的多重检测，方法准确、快速、高敏感性[8]；以沙门氏菌（invA）、单增李斯特菌（hlyA）、金黄色葡萄球菌（nuc）和肠出血性大肠杆菌O157：H7（rfbE）为靶基因设计引物，研究多重检测致病菌的检测方法[9-13]；利用多重荧光定量PCR-探针法检测高致病性沙门氏菌血清型[14]等。

在我国，根据GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》的要求，食品检测的主要致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7和副溶血性弧菌。目前，利用PCR技术结合高分辨率熔解曲线的检测方法针对该5种致病菌报道较少，因此，试验以该5种致病菌为研究对象，以门店现制现售的果蔬饮料为基质，结合病原微生物增菌时间，建立快速检测餐饮食品中5种致病菌的方法体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

采用的菌株均采购自美国菌种保藏中心（American Type Conservation Center，ATCC），详见表 1。

1.1.2 主要试剂

缓冲蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陆桥技术股份有限公司；荧光定量PCR预混试剂SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）：宝生物工程（大连）有限公司。

表1 菌株名称及编号Table 1 Name and number of the bacteria

1.1.3 引物

查阅标准，参考SN/T 1689-2007《食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》标准中列出的引物序列，见表2，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 目标菌的引物序列Table 2 Primers of 5 pathogenic bacteria

1.1.4 主要仪器

荧光定量PCR仪（LightCycler 480-Ⅱ）：罗氏诊断产品（上海）有限公司；干式恒温器（MK-10）：杭州奥盛仪器有限公司；快速混匀器（XK96-A）：江苏新康医疗器械有限公司；冷冻离心机（Legend Micro 21R）、超微量核酸测定仪（NanoDrop OneC）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；生化培养箱（SPX-400-Ⅱ）：上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 致病菌梯度培养

在BPW培养液中分别接种5种致病菌，并按照每降低10倍配制细菌稀释液，将各梯度进行平板计数，结果见表3。并将各梯度细菌稀释液置36℃温度下增菌培养，每隔1 h取混匀的增菌液1 mL，提取DNA，进行检测分析，旨在获取各目标菌的最短增菌时间，以达到缩短检测时间的目的。

表3 各稀释梯度平板计数的菌含量Table 3 The content of 5 pathogenic bacteria in different dilution （CFU/mL）

1.2.2 DNA模板提取

将目标菌接种于果蔬饮料中，振荡涡旋后取样提取目标菌DNA。取1 mL样液加入到1.5 mL灭菌离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清液；随后加入50 μL灭菌蒸馏水，并用快速混匀器混匀，放入100℃干式恒温器中裂解10 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液于另一灭菌离心管中，该溶液即为DNA提取液。吸取上清液时不能吸到底部沉淀物，测定DNA模板浓度及纯度。

1.2.3 RT-PCR体系的建立

根据SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书，配置20 μL的PCR反应体系，其中包含10 μLSYBRPremixEXTaq（TliRNaseHPlus）（2×），0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL 下游引物（10 μmol/L），2 μL DNA（样品以目标菌DNA为模板，对照以无菌去离子水的模板）。

反应程序为：95℃预变性30 s；以95℃变性5 s，58℃退火30 s，72℃延生10 s，扩增40个循环。PCR产物随后进行熔解曲线分析，熔解程序为：95℃5 s，60℃1 min；然后升温至95℃（熔解速率为0.11℃/s），最后50℃冷却。

1.2.4 RT-PCR反应特异性

在RT-PCR反应体系建立的基础上，分别对表1所示的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌，进行了特异性检验。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR体系的建立

在RT-PCR反应时，针对以上5种目标菌特异性引物的退火温度，在55℃～65℃范围内进行预试验，结果表明，5种目标致病菌在退火温度为58℃时均能够获得良好的扩增，且非特异性扩增不明显，因此PCR试验选择58℃作为反应程序的退火温度，各目标菌梯度稀释液的熔解曲线峰见图1～图5，并计算平均Tm值。

图1 沙门氏菌的熔解曲线峰Fig.1 The melting curve of Salmonella

由图1～图5可知，沙门氏菌的Tm值为87.32℃，金黄色葡萄球菌为79.57℃，大肠埃希氏菌O157：H7为82.24℃，副溶血性弧菌为87.15℃，单核增生李斯特氏菌为82.02℃。可见，5种目标菌的Tm值部分有一定的相似性，尤其是沙门氏菌和副溶血性弧菌，大肠埃希氏菌O157：H7和单核增生李斯特氏菌，重合性较高，在多重RT-PCR反应时可能存在相互影响难以区分。通过进一步试验也证明了这点，试验将单重体系中的模板稀释至相似浓度后，直接混合在一起进行多重RT-PCR反应，熔解曲线重合度较高，不能有效检测。因此，本试验采用相同的RT-PCR检测体系对5种目标菌分别进行检测。

图2 金黄色葡萄球菌的熔解曲线峰Fig.2 The melting curve of Staphylococcus aureus

图3 大肠埃希氏菌O157：H7的熔解曲线峰Fig.3 The melting curve of Escherichia coli O157：H7

图4 副溶血性弧菌的熔解曲线峰Fig.4 The melting curve of Vibrio Parahemolyticus

图5 单核增生李斯特氏菌的熔解曲线峰Fig.5 The melting curve of Listeria monocytogenes

2.2 致病菌增菌时间

通过对5种致病菌梯度稀释液的培养，找到5种致病菌平板计数为个位数、且经培养后采用RT-PCR体系检测均达到阳性的最短增菌时间，见表4。

表4 5种目标菌达到检测灵敏度时的增菌时间Table 4 The enrich time of 5 pathogenic bacteria

由表4可知，沙门氏菌、副溶血性弧菌增菌2 h后，即能被检出，而其余3种菌培养7 h～8 h后，也能被检出。可见，不同的菌其生长率各不相同，在检测1种菌时，可针对性地选择合适的培养时间，以达到提高检测效率的目的；而在对5种目标菌进行同时检测时，样品增菌8 h后进行检测，能达到或超过检测灵敏度而被检出。

2.3 RT-PCR反应灵敏度

随着菌液稀释梯度的不断增加，其Ct值相应增大。通过对5种致病菌的梯度检测，结合平板计数结果显示，该方法对沙门氏菌的检测灵敏度为8.0×10CFU/mL，金黄色葡萄球菌为2.4×103CFU/mL，单核增生李斯特氏菌为1.3×103CFU/mL，大肠埃希氏菌O157：H7为2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌为 7.4×10 CFU/mL。其平均Ct值范围在31.04～34.86之间。试验结果表明，上述RT-PCR反应体系对该5种目标菌的检测均具有良好的灵敏度。

2.4 RT-PCR反应体系中引物的特异性

本试验的反应体系中，混合5种致病菌的DNA模板，分别对5组引物进行特异性试验，5种目标菌的扩增曲线见图6，熔解曲线峰见图7。

图6 5种目标菌Real-time PCR扩增图谱Fig.6 The Real-time PCR curve of 5 pathogenic bacteria

由图6、图7可知，5种目标菌扩增效果较好，Tm值分别为沙门氏菌87.48℃，金黄色葡萄球菌79.47℃，单核增生李斯特氏菌81.68℃，大肠埃希氏菌O157：H7 82.04℃，副溶血性弧菌87.09℃，与2.1试验结果一致，标准偏差范围在0.04℃～0.14℃之间，该反应体系中各引物对具有较好的特异性。

图7 5种目标菌的熔解曲线峰Fig.7 The melting curve of 5 pathogenic bacteria

3 结论

试验建立了熔解曲线结合RT-PCR快速检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌5种致病菌的方法体系。通过对培养时间的比较，分别获得5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间，增菌时间范围为2h～8h，试验灵敏度分别为沙门氏菌8.0×10CFU/mL，金黄色葡萄球菌2.4×103CFU/mL，单核增生李斯特氏菌1.3×103CFU/mL，大肠埃希氏菌O157：H7为2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌7.4×10 CFU/mL。5种目标菌的Tm值分别为沙门氏菌87.32℃，金黄色葡萄球菌79.57℃、单核增生李斯特氏菌82.02℃、大肠埃希氏菌O157：H782.24℃、副溶血性弧菌87.15℃。试验采用水煮法[15]直接提取样品中的DNA，其操作简单，提取时间短，DNA纯度范围在1.4～1.8之间，能满足PCR检测要求。通过该方法体系的建立，针对以上5种致病菌，检验过程简单方便，与常规微生物检测方法比较，大大提高了检测时效性，且该方法的灵敏度、特异性均满足要求，为实现餐饮食品中微生物的快速检测提供参考。

试验发现，由于不同致病菌的生长速率不同，在增菌时间上各有差异，检测时可根据具体检测目标菌选择不同的增菌时间，以缩短检验时间。反应体系建立时，退火温度是关键条件，要根据目标菌引物的特性调整退火温度，使得在相同退火温度等PCR参数条件下实现同步检测的目的。另外，简单地把模板DNA和引物混合起来，由于DNA和引物对之间的相互影响，利用熔解曲线检测效果并不理想。但试验建立的反应体系，在仅混合DNA模板而不混合引物时，同时检测5种目标菌，具有较好的扩增曲线，且引物对的特异性也较好。