赵孔祥，高健会，宓捷波，刘旸，葛宝坤，郑文杰

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300461；2.天津师范大学生命科学学院，天津300387）

随着我国经济的发展，人们对葡萄酒的认识不断提升，葡萄酒在国内无论是产量还是消费量增长十分迅速，中国已经成为全球第五大葡萄酒消费国。为了获得高额利润，部分不法商家进行了产地造假、原材料造假、品牌造假等，这些行为严重危害了消费者的权益。葡萄酒真伪的鉴别越来越受到重视，针对葡萄酒的制假问题，欧盟开发了葡萄酒数据库银行，用于对葡萄酒的真实属性进行鉴定[1]，但我国在葡萄酒鉴定方面的研究还非常薄弱。

葡萄酒消费者习惯于根据葡萄酒标签来判定葡萄酒的优劣，其中葡萄酒产地和产区最受关注，但目前还没有有效方法能对葡萄酒产地进行鉴别与溯源。国际上葡萄酒产地溯源的方法越来越多，例如无机元素指纹法[2-3]、香气指纹法[4-5]，以及稳定同位素比值法[5-10]等，其中稳定同位素比值能很好地指示地域和气候特性，目前已经成为产地溯源的重要方法[8，11]。目前，已有液相色谱-稳定同位素质谱测定葡萄酒中的乙醇（ethanol）、丙三醇（glycerol）的方法，但由于液相色谱法必须用水作为流动相，能分析的物质有限，目前仅能分析乙醇和丙三醇[9]。气相色谱-燃烧-稳定同位素比率质谱法对所分析物质限制较少，可以分析葡萄酒中更多的风味物质，并且由于前处理简便，可以保证测定速度和准确性[10]。不同产地葡萄酒可能由于葡萄品种和酿造方式的差异导致风味物质稳定同位素组成的变化，因此风味物质的稳定同位素比值可作为产地溯源的指标[12]。本研究采用气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱仪（gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometer，GC-C-IRMS），建立了葡萄酒中乙醇、丙三醇、2，3-丁二醇（2，3-butanediol）、乳酸乙酯（ethyl lactate）、异戊醇（3-methyl butanol）、乙酸（acetic acid）6种风味物质碳稳定同位素比值的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

DELTA V Advantage同位素质谱仪（配备Trace 1310气相色谱仪与GCIsolink接口）、ISQ质谱仪（配备Trace GC气相色谱仪）：美国Thermo Fisher公司；MILLI-Q纯水器：美国Millipore公司。

1.1.2 试剂

He（99.999%）、CO2参考气：北京氦普分气体有限公司；乙醇同位素标准物质（BCR-656，欧洲标准物质中心，啄13CVPDB=-26.91‰±0.07‰），甘油（标准品，纯度≥99.9%）、3-甲基丁醇（标准品，99.9%）、丙三醇（标准品，99.9%）：德国 Dr Ehrenstorfer；乳酸乙酯（标准品，≥99.9%）、乙酸（标准品，99.9%）：上海安谱实验科技有限公司。

1.2 样品前处理方法优化

所有标准品均用水配制为适当浓度，溶液峰高以与样品中该物质峰高接近为宜。取2 mL样品，过0.45 μm水系滤膜，进样分析，如果峰高过大，需调整进样口分流比至适当后再做分析。

1.3 色谱条件优化

优化不同组分测试的气相色谱升温程序，使各组分得到良好的分离；优化进样量及进样口分流比，使样品中待测物质信号与参考气信号相当。

1.4 葡萄酒中2，3-丁二醇的确认

将葡萄酒样品注入气相色谱-质谱仪，全扫描方式采集（质量数设定为20 m/z～200 m/z），对特征峰进行NIST谱库检索。

1.5 精度和准确性试验

根据样品中风味物质含量配制水平相当的标准品溶液，乙醇浓度配为2%，甘油浓度配为5 mg/mL，异戊醇、乳酸乙酯、乙酸配制为1.0 mg/mL，分别测定10次，计算测定结果的标准偏差（standard deviation，SD）。

1.6 稳定性试验

随机选取某葡萄酒样品进行7次重复测定，计算其SD值。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

葡萄酒中各风味物质含量差别较大，乙醇是糖的发酵产物，含量通常为7%～16%，甘油是酒精发酵的主要副产物，其含量通常为5 g/L～12 g/L。葡萄酒的主要风味物质包括醇类、酯类和有机酸等，其中异戊醇（3-甲基丁醇）、2，3-二丁醇、乳酸乙酯、乙酸几种风味物质含量较高，一般为几十至几百毫克每升[13]。

由于葡萄酒中乙醇含量太高，样品需要进行稀释，当样品稀释5倍时，通过结合减少进样量至0.1 μL和增加分流比至50∶1，样品信号基本上在10 000 mV左右，同位素比值较稳定。其他项目可以通过调整分流比及进样量获得合适的信号值，因此样品可以直接测定。

2.2 气相色谱条件优化

色谱柱：由于乙醇、乙酸、甘油等风味物质均为极性化合物，选择WAX柱分离效果最好，因此最终选择DB-wax气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

由于乙醇含量较高，应尽可能减少进样量，同时要增大分流比，最终优化后乙醇测定色谱条件为：进样量0.1 μL，进样口温度250℃，载气为高纯He，流速1.5 mL/min，分流比50∶1。程序升温条件：初温40℃，保留1 min，50℃/min升温至220℃，保留3 min。

其他组分仅通过增加分流比即可得到最佳的信号强度。优化后色谱条件如下。

甘油分析：进样量0.5 μL，进样口温度270℃，载气为高纯He，流速1.5mL/min，分流比10∶1。程序升温条件：初温80℃，保留1 min，15℃/min升温至240℃，保留2 min。

其它风味组分：进样量0.5 μL，进样口温度250℃，载气高纯He，流速1.5 mL/min，分流比5∶1。程序升温条件：初温80℃，保留1 min，15℃/min升温至240℃，保留2 min。

优化后标准品溶液及样品同位素质谱图见图1和图2。

2.3 葡萄酒中2，3-丁二醇的确认

葡萄酒样品分析中发现乙酸出峰后面有一与其峰高接近的峰，其碳同位素比值也与乙酸及其他组分接近，该峰可能也是一种风味物质。为确认该未知峰，采用气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometer，GC-MS）全扫描进行样品分析，色谱条件与与GC-C-IRMS条件相同，葡萄酒样品全扫描总离子流图见图3。

对主要色谱峰进行NIST谱库检索，确认峰1为异戊醇，峰2为乳酸乙酯，峰3为乙酸，与同位素质谱色谱峰结果相吻合。峰4对应同位素质谱图中383 s的色谱峰，对其质谱图进行检索结果见图4。

该色谱峰与NIST谱库主库（mainlib）中2，3-二丁醇质谱图吻合度最高。根据文献报道，葡萄酒中一般均含2，3-二丁醇这一风味物质[13]，因此基本可确认该同位素峰为2，3-二丁醇。

图1 标准品溶液同位素质谱图Fig.1 Chromatography of standard solution about five flavours

图2 葡萄酒样品风味物质同位素质谱图Fig.2 Chromatography of wine about five flavours

2.4 精度和准确性

2%乙醇溶液，5 mg/mL甘油溶液，1.0 mg/mL的异戊醇（3-甲基丁醇）、乳酸乙酯、乙酸混合溶液，分别测定10次，计算测定结果的标准偏差（SD），结果如表1所示，均达到国际通行质控标准要求（SD小于0.3‰）[14]。

2.5 稳定性

葡萄酒样品基质复杂，其他部分未知成分可能干扰色谱分离，进而影响测定结果精度，为了验证方法的稳定性，随机选取1只葡萄酒样品进行7次重复测定，计算其SD值，结果见表2，各物质SD小于葡萄酒样品的分析误差0.6‰[15]。

2.6 实际样品测定

采用本方法测定3种法国和2种南非的葡萄酒中

图3 葡萄酒样品全扫描总离子流图Fig.3 Chromatography of total ion current of wine in fullscan model

图4 葡萄酒样品未知峰NIST谱库检索结果Fig.4 Results of searching in the library of NIST about unkown peak in wine

表1 5种风味物质碳同位素比值Table 1 Carbon isotope ratio of five flavour characters about standard solution

表2 葡萄酒样品6种风味物质碳同位素比值Table 2 Carbon isotope ratio of six flavour characters about wine

表3 法国和南非部分葡萄酒样品碳同位素比值Table 3 Carbon isotope ratio of French and South African several wines

通过进一步增加样品量，结合统计分析，比较不同产地风味物质同位素比值差异，有可能为葡萄酒产地分析提供更加丰富的信息。

3 结论

GC-C-IRMS可以实现葡萄酒中6种风味物质的碳稳定同位素比值测定，而常用分析方法仅能分析乙醇、甘油的碳同位素比值，本方法可以分析葡萄酒其他风味物质的差异，以期进一步发现酿制工艺、产地差异的影响，通过进一步增加样品量结合统计分析，为葡萄酒溯源分析提供依据。