黄伊嘉，唐善虎，李思宁

（西南民族大学生命与科学技术学院，四川成都610041）

风干牦牛肉是我国民族地区特色产品，因其天然原味，深受消费者喜爱。然而，由于制作工艺传统、生产方法局限，我国大多数传统的腌制肉类产品仍然处在缓慢发展的低层次阶段。因而受经济利益的驱动，部分用于防腐、除虫和灭鼠的农药被投入到生产过程中[1-2]。敌百虫（C4H8O4Cl3P）是一种在渔业和畜牧业的生产中应用比较广泛的重要杀虫剂，作为有机磷酯类化合物，它具备残留低、毒性小和效率高等特点，对线虫、吸虫类等的杀灭收效良好[3-4]。但敌百虫在哺乳动物的繁殖及其脑干神经细胞存在明显的毒副作用，这在最近几年就有确切的证据显示[5]。若食品中添加敌百虫进入人体，会伤害器官功能，遗传物质会因此发生改变。卫生部2011年发布了《食品中可能违法添加的非食用物质名单》，明确规定在火腿、腊肉、咸鱼等制品中禁止添加敌百虫[6]。然而，我国现有食品安全标准并未针对风干牦牛肉中敌百虫的残留量做出限量要求。因此，开展风干牦牛肉中敌百虫残留量的检测方法研究意义重大。

目前，检测农产品中敌百虫残留的方法有红外光谱法[7]、分子印迹法[8-9]、电化学法[10-11]、生物传感技术[12-14]和色谱法等。其中研究较多、应用较广泛的主要是色谱法，检测样本包括水样、植物、水产品和动物制品等[15]。动物源性食品的国家标准中对敌百虫的检测提出了液相色谱-质谱/质谱法[16]，该方法具有灵敏度高、适用性广、选择性好等优点，但对仪器和操作人员的水平要求较高，不具有普遍推广性。对于动物源性样品的净化，主要是采用凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography、GPC）和液液萃取法（liquid-liquid extraction、LLE）两种净化方式[17]。虽然GPC技术先进，但溶剂消耗量大，仪器昂贵且运行成本高，一般试验室不具备配备条件。因此，本研究将参考已有相关方法，通过一系列试验筛选确定最佳前处理方法和仪器分析条件，建立一种使用液液萃取-气相色谱质谱联用法测定风干牦牛肉中敌百虫残留量的新检测方法，达到准确、便捷、高效的分析要求。

1 材料与方法

1.1 试剂

敌百虫标准物质：纯度＞98%，德国DR.E公司；无水硫酸钠（分析纯）：在650℃灼烧4 h后贮于干燥器备用，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸锌（分析纯）：西陇化工股份有限公司；乙酸乙酯（色谱纯）：成都市科隆化学品有限公司；乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；试验用水为超纯水。

1.2 仪器设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；FJ-200可调高速均质机：常州市金坛大地自动化仪器厂；R-215旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；5804高速离心机：德国Eppendorf公司；ML204电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；50mL离心管：美国Thermo Fisher公司；250 mL分液漏斗、三角漏斗、浓缩瓶：天津市天科玻璃仪器制造有限公司；0.20 μm的有机相针头滤膜：天津市津腾实验设备有限公司。

1.3 气相色谱-质谱（gas chromatographic-mass spectrometric，GC-MS）条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱采用HP-5MS毛细管柱 [30 m×0.25 mm×0.25μm（膜厚）]，载气为高纯氦气，恒流（流速1mL/min），进样量为2 μL，进样口温度在一定范围内（200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300 ℃） 逐渐升高，进样方式分别选择不分流和脉冲不分流两种，柱箱升温程序采用8种不同保持时间组合（3个阶段温度分别为：50、170、200℃）。

1.3.2 质谱条件

EI源，轰击电压70 eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，辅助接口温度260℃；采集模式：全扫描和选择离子监测（selected ion monitor，SIM）；扫描范围：50 amu～550 amu；溶剂延迟：根据出峰时间确定。特征选择离子见表1。

表1 特征选择离子和定量离子Table 1 Feature selection ions and quantitative ions

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

取一定量（250 g左右）的风干牦牛肉样品切成小块，取样方法采用四分法。所取的样品平均分成2份，1份用于试验测定，另1份放置于冰箱中保存，备用。在组织捣碎机中粉碎待测样品成匀浆或均匀粉状[18]。

1.4.2 样品提取

称取样品5.0 g、乙酸锌0.5 g，加入50 mL离心管中，再加入一定浓度（水+乙腈体积比：1+9、2+9和1+1）乙腈溶液20 mL，使用均质机均质2 min，将离心管置于高速离心机中以一定速率（4 000、5 000、6 000 r/min）离心一定时间（2、3、4、5 min），转移上清液至250 mL分液漏斗中。再向离心管中的残渣加入20 mL乙腈溶液，均质机均质2 min，离心机离心一定时间，合并上清液于同一分液漏斗中[19]。

1.4.3 样品净化

将80 mL 20 g/L的硫酸钠水溶液加入上述分液漏斗中，振荡混匀。再向分液漏斗中加入20 mL选定的萃取溶剂（三氯甲烷、二氯甲烷和饱和乙酸乙酯），剧烈振荡2 min，静置分层，重复萃取两次后合并萃取液。将萃取液通过无水硫酸钠，滤入干净干燥的浓缩瓶中，用旋转蒸发器浓缩至近干，定量加入2 mL选定的溶剂。溶液使用漩涡混匀器混匀后通过0.20 μm有机相滤膜，过滤后上机测定。同时做空白对照[19-20]。

2 结果与讨论

2.1 定量方法的确定

使用气相色谱质谱联用仪对敌百虫标准品进行分析，根据相关研究报道可知，敌百虫受热后极易发生分解，三氯乙醛、亚磷酸二甲酯和敌敌畏是3种主要分解产物，见图1、图2。

图1 敌百虫标准溶液3.5 min～4.5 min全扫描图Fig.1 Full scan chromatogram of trichlorfon from 3.5 min to 4.5 min

图2 敌百虫标准溶液10.5 min～12.5 min全扫描图Fig.2 Full scan chromatogram of trichlorfon from 10.5 min to 12.5 min

由于存在分解会使测量敌百虫母体变得非常困难，结果准确性无法保证，因此可以通过测定分解产物的含量对敌百虫进行定量。在食品的农残分析中，某些分析对象自身常会含有微量的三氯乙醛或敌敌畏[21]，而在自然条件下亚磷酸二甲酯易分解，是一种在环境中极少可能会存在的农药中间体[22]，所以本方法选择以亚磷酸二甲酯的含量对敌百虫进行定量。根据图2中亚磷酸二甲酯的出峰时间，确定溶剂延迟时间为3.6 min。亚磷酸二甲酯质谱全扫描如图3。

图3 亚磷酸二甲酯质谱全扫描图Fig.3 Full scan MS-spectrum of dimethyl phosphite

2.2 进样口温度的确定

随着进样口温度的升高，敌百虫的量逐渐减少，而分解产物的量逐渐增大[21]。进样口的温度过低（200℃以下），对分析实际应用意义不大，且极易污染进样口，最高可达到300℃。因此本试验在200℃～300℃范围内，通过逐步升高色谱进样口温度，考察了进样口温度变化对敌百虫分解率的影响，见图4。

图4 亚磷酸二甲酯含量随进样口温度变化图Fig.4 Dimethyl phosphite content diagram of different inlet temperature

温度从200℃升至260℃时，亚磷酸二甲酯的含量逐渐增加，在260℃～300℃区间，含量趋于平缓，并达到相对稳定的状态。如选择200℃～250℃温度段，此时敌百虫的分解量处在上升阶段，样品响应值不理想且不稳定的状态会导致重现性不好。根据试验数据分析，选择进样口温度260℃较为适宜，该温度也是气相色谱分析中的常用温度。

2.3 提取条件的选择

作为极性较强的有机磷农药，敌百虫在三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈等试剂中的溶解度较好，使用三氯甲烷或乙酸乙酯作为有机磷的提取溶剂比较常见。然而，蛋白、脂肪等杂质在肉类食品中含量较高。而类脂化合物在乙腈中的溶解度较差，动物蛋白又能很好的沉淀下来[23]，因此乙腈作为肉类食品的提取溶剂。常用为1+9或2+9乙腈溶液[19，23-24]，对于某些干肉类食品，可选用1+1乙腈溶液，以保证乙酸锌的净化作用。本试验分别使用1+9、2+9和1+1乙腈溶液对风干牦牛肉样品进行两次提取，同时做平行试验。考察不同浓度的乙腈溶液对提取率的影响，见表2。

表2 不同浓度乙腈溶液对样品的提取率结果（n=3）Table 2 Sample extraction rate results in different concentrations of acetonitrile（n=3）

由表2结果可知，1+1乙腈溶液对样品的提取率高于另外两个浓度，且达到95%以上，满足分析要求，因此提取溶剂选择1+1乙腈溶液。

使用高速离心机分离提取时，查阅大量文献，通常选用4 000 r/min离心3 min[19，23-24]。本试验选择离心速率为4 000、5 000、6 000 r/min时分别对样品液离心2 min～5 min，测定不同离心速率和时间组合的提取率，见表3。

表3 不同离心条件对样液的提取率结果Table 3 Sample extraction rate results in different centrifugal conditions

由表3结果可知，当离心速率为5 000 r/min以上，提取率可以达到97%，满足分析要求。在此条件下增加离心速率和时间不会带来提取率的显著提升，因此遵循高效、简捷的原则，确定离心条件为：以5 000 r/min的速率离心2 min。

2.4 净化溶剂的选择

查阅相关文献可知，在肉类食品样液的净化过程，提取液常使用三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯进行净化处理[19-20，23-24]。本试验使用三氯甲烷、二氯甲烷和饱和乙酸乙酯分别萃取提取液，比较萃取效果，见表4。

表4 不同净化溶剂对提取液的萃取效果比较Table 4 Comparison of extraction effect in different purificants

根据表4比较结果，选择饱和乙酸乙酯作为净化溶剂。此处使用硫酸钠饱和的乙酸乙酯，可以排除硫酸钠水溶液中带来部分水分的影响，同时在相转移过程，减少了因更换不同溶剂造成萃取过程中样品的损失。在风干牦牛肉中加入敌百虫标准品进行试验，结果谱图显示了较少的杂质峰，并且不会对目标物的测定产生影响，表明净化试验取得了理想的效果。空白溶液、样品溶液、添加敌百虫样品液全扫描和选择离子扫描色谱图如图5～图7。

图5 空白对照溶液全扫描图Fig.5 Full scan chromatogram of blank control

图6 样品溶液全扫描图Fig.6 Full scan chromatogram of sample

图7 样品添加标样选择离子扫描图Fig.7 Sim scan chromatogram of spiked sample

2.5 进样方式的选择

敌百虫在进样时极易发生分解，因此研究了不分流和脉冲不分流两种进样方式对其稳定性的影响，见图8。

由图8可知，采用不同的进样方式时，敌百虫分解产生亚磷酸二甲酯的含量存在显著差异，因此选择脉冲不分流的方式进样，更有助于利用其进行定量分析。

图8 亚磷酸二甲酯含量与进样方式的关系图Fig.8 Dimethyl phosphite content diagram of different injection methods

2.6 柱箱程序时间的确定

考察亚磷酸二甲酯含量在8组不同保持时间组合（如表5）的柱箱程序中的变化（如图9），选择最佳柱箱程序为：50℃保持2 min，10℃/min升至170℃保持3 min，20℃/min升至200℃保持1 min。

表5 8组不同保持时间组合Table 5 8 groups of different hold time

图9 亚磷酸二甲酯含量与柱箱程序的关系图Fig.9 Dimethyl phosphite content diagram of different oven programs

2.7 线性范围

用乙酸乙酯逐级稀释浓度为100 μg/mL的敌百虫标准溶液，配制成浓度为 0.05、0.1、0.5、1、2、5 μg/mL的标准系列溶液。按上述测定条件上机测定，以亚磷酸二甲酯的定量离子峰面积对浓度绘制标准曲线。在0.05 μg/mL～5 μg/mL 浓度范围内，峰面积（Y）与浓度（X）的线性回归方程为Y=4 310 000X+52 173，线性相关系数达到0.999 9，线性关系良好。

2.8 方法精密度与回收率

称取5.0 g风干牦牛肉空白样品，分别加入敌百虫标准溶液0.25、0.5、10 μg作为3个加标水平，同时各做6份平行处理，按照1.4的处理方法制备样品加标溶液，精密度与回收率试验结果见表6～表7。

由表中数据可以看出，样品的RSD为2.8%～5.1%，本方法的室内精密度试验结果符合测定的要求。加标3个水平样品回收率范围为85.3%～102.3%，本方法的回收率结果理想，符合农药残留检测的要求。查阅其他相关文献方法，殷帅等[19]使用乙腈-三氯甲烷-正己烷液液萃取法处理干制鱼样品，GC-MS上机测试，所得精密度范围为4.3%～6.9%，回收率范围为84.8%～107.7%；张卫锋等[20]使用乙腈-乙酸乙酯液液萃取法处理咸鱼样品，GC-FPD上机测试，所得精密度范围为3.82%～5.80%，回收率范围为84%～99%；农业部783号公告-3-2006《水产品中敌百虫残留量的测定气相色谱法》[24]使用乙腈-三氯甲烷液液萃取法处理水产品样品，气相色谱法上机测试，所得精密度≤10%，回收率≥75%。对比可知本方法的精密度与回收率结果均较其它方法更理想。

表6 精密度试验结果（n=6）Table 6 Results of precision test（n=6）

表7 回收率试验结果Table 7 Results of recovery test

2.9 方法检出限

对风干牦牛肉空白样品进行加标回收试验，在敌百虫标准品添加水平为0.02 mg/kg时，得到亚磷酸二甲酯定性离子的信噪比等于3，因此本方法的检出限为0.02 mg/kg。查阅其他相关文献方法，农业部783号公告-3-2006《水产品中敌百虫残留量的测定气相色谱法》[24]使用乙腈-三氯甲烷液液萃取法处理水产品样品，气相色谱法上机测试，所得检出限结果为0.04 mg/kg。对比可知本方法的检出限水平高于标准使用的液液萃取-气相色谱法，可以满足敌百虫限量检测的要求。本方法改进了前处理过程中使用的萃取溶剂的种类和浓度，提高了前处理效率，使用了定量更准确的GC-MS法进行上机测试，优化了仪器参数，针对被检样品特性使仪器达到最佳检测状态，因此本方法更具有推广泛先进性。

3 结论

本试验采用气相色谱质谱联用法，选择最佳仪器分析条件，线性相关性和结果精密度均能满足敌百虫的测定要求。前处理方法选取适合的提取和净化条件组合进行萃取，有效减少中间步骤带来的损失，且试剂相比传统方法用量更合理，回收率更好。使用本方法测定风干牦牛肉中的敌百虫残留，操作简捷、灵敏度高、重复性好、杂质干扰少、测定结果达到了我国对敌百虫残留分析的要求。该研究为肉类敌百虫的检测提供了新方法，对风干牦牛肉中敌百虫检测和安全监控具有重要意义。