黄梦明，田鹏，刘占奇，李良，2，董孝元，2，*

（1.黄鹤楼酒业（咸宁）有限公司，湖北咸宁430007；2.武汉雅仕博科技有限公司，湖北武汉430050）

桂花（Osmanthus fragrans）系木犀科常绿灌木或小乔木，又名木犀、岩桂、九里香、金粟。原产于中国西南部，四川、云南、广西、广东和湖北等均是其产地[1]。桂花是中国十大传统名花之一，在我国具有悠久的历史[2]。

桂花不仅是具有高观赏性的花卉植物，还是一种健康食品，富含大量的活性健康成分，其中黄酮类、多酚类等活性物质在桂花中含量非常高。黄酮类物质和多酚类物质作为植物中存在的天然抗氧化剂，对人体内各种自由基具有一定抑制作用[3-5]。

随着经济发展和时代的变迁，饮酒的习惯也在逐渐改变，健康、个性化开始受到人们的关注。桂花酒作为一款露酒，可以很好的满足现代人群的要求，具有很高的开发价值。市场上主流的桂花酒可分为两种，一是以桂花为原料发酵酿造的桂花酒，二是以桂花为原料浸提生产的桂花酒，这两种桂花酒各有特色，而通过现代技术分离纯化桂花中生理活性成分生产出的新型桂花酒，是目前一种新的发展趋势[6-11]。

本试验通过研究桂花酒的生产工艺中的浸提工艺，开发一种新型桂花酒，并且分析其活性成分，对其抗氧化能力进行评价，为新型桂花酒的开发和发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜桂花：咸宁市桂花镇；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；无水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、水杨酸、邻苯三酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；VC、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：北京坛墨质检科技有限公司；Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）、AB-8型大孔树脂：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ME104E型电子分析天平：梅特勒-托利多（中国）有限公司；UV-2700分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；HH-S型电热恒温水浴锅：上海索普仪器有限公司；SF-TGL-16M台式高速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；KQ-250E超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Biosafer-18A（普通型）立式冻干机：赛飞（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桂花提取物的制备

桂花活性成分提取：取已筛选好的新鲜桂花按照1∶4（g/mL）的比例加入70%乙醇，在60℃下振荡提取2 h，过滤，取滤液在55℃下进行减压蒸馏，制得提取液。

桂花活性成分纯化：取经过前处理后装柱好的AB-8型大孔树脂按照1∶10（g/mL）提取液的比例上柱，径高比控制在1∶15，上柱液流速控制在2 BV/h，上柱完毕后，用3 BV/h水进行冲洗杂质60 min，然后用70%乙醇按3 BV/h洗脱树脂80 min，收集洗脱液，经减压蒸馏后，进行冷冻干燥，得到桂花提取物的提取比率为20∶1。

1.3.2 新型桂花酒的生产工艺

3.5%桂花提取物→原酒浸提→过滤→澄清→过滤→桂花酒原酒→调配→灌装→成品

1.3.3 感官评价

参照GB/T 27588-2011《露酒》中及GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对露酒的感官评价及综合分析方法对样品色泽、澄清度、香气、滋味和风格指标进行评分[12-13]。确定具体分值并建立感官评价表，如表1所示，按照表1中所列各项标准对样品进行评分。

表1 桂花酒感官评价表Table1 Osmanthus wine sensory evaluation form

1.3.4 桂花酒中黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al（NO3）3法[14-15]进行总黄酮的测定，以芦丁为标准品作标准曲线。

对桂花提取物中的原酒提取过程中的总黄酮含量进行检测，计算出桂花提取物在浸提条件下的提取率。

1.3.5 新型桂花酒的浸提工艺单因素试验

以感官评价和总黄酮提取率评价指标，对提取物浸提的酒精度、浸提温度、浸提时间进行单因素试验，再通过正交试验优化，得到最佳生产工艺。

1.3.5.1 桂花酒浸提酒精度的单因素试验

选择酒精度为40%、50%、60%、70%vol的同种原酒对桂花提取物在75℃，提取2h，以桂花酒的感官评价得分及总黄酮的提取率为评价标准，得到最佳酒精度。

1.3.5.2 桂花酒浸提温度的单因素试验

选择酒精度为60%vol的同种原酒对桂花提取物在 55、65、75、85℃，提取 2 h，通过桂花酒的感官评价得分及总黄酮的提取率，得到最佳浸提温度。

1.3.5.3 桂花酒浸提时间的单因素试验

选择酒精度为60%vol的同种原酒对桂花提取物在75℃提取1、2、3、4 h，通过桂花酒的感官评价得分及总黄酮的提取率，得到最佳浸提时间。

1.3.6 新型桂花酒的浸提工艺优化

根据单因素试验结果，以浸提原酒的酒精度、浸提温度、浸提时间为因素，采用三因素三水平做正交试验，以确定最佳浸提工艺条件。

1.3.7 桂花酒抗氧化试验

1.3.7.1 清除DPPH自由基

参考Jun的方法[16]，精确称取12.5 mg DPPH标准品，用无水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.34 mmol/L的DPPH-乙醇溶液备用。精确量取125 mg/L的DPPH-乙醇溶液4 mL加入到加水稀释后质量浓度为20 mg/L～100 mg/L（以黄酮质量浓度计）的桂花酒溶液8.0 mL中。摇匀后于避光处静置30 min进行反应，在517 nm波长处测定吸光度A1。以蒸馏水作为空白对照A0。以等质量浓度的加水稀释的桂花提取液，BHT和VC为对照。DPPH自由基清除率公式：

1.3.7.2 清除羟基自由基

参考文献中的方法[17-18]，取加水稀释后质量浓度为20 mg/L～100 mg/L（以黄酮质量浓度计）的桂花酒成品溶液10 mL添加到比色管中，依次添加2 mL 6 mmol/L水杨酸，2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，摇匀，37℃下保温30 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液在510 nm处检测吸光度值AX。将样品用去离子水代替检测吸光度值为A0，将双氧水用去离子水代替检测吸光度值为A1。取稀释后的桂花提取液，BHT和VC等质量浓度加入作为对照。羟基自由基清除率计算公式：

1.3.7.3 清除超氧阴离子自由基

参照文献的试验方法[19-20]，将0.1 mol/L pH 8.2 Tris-HCl溶液和6 mmol/L邻苯三酚在25℃下水浴保温10 min，之后取5.7 mL pH 8.2 Tris-HCl溶液于比色管中，向比色管添加用水稀释后质量浓度为50 mg/L～200 mg/L（以黄酮质量浓度计）的桂花酒成品溶液0.20 mL，最后加入0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，立即在325nm下测定其吸光度变化的动态曲线，测定时间为5min，通过动态曲线得到其自氧化速率为V1。以0.20 mL去离子水代替样品作为空白对照，测定其自氧化速率为V0，空白自氧化速率控制在60 mAbs/min左右为宜。以等质量浓度的BHT和VC加入作为对照。超氧阴离子自由基清除率计算公式：

1.4 数据统计

采用Origin 2018和SPSS 24.0软件进行数据处理和统计分析。所有样品均平行测定3次，测定结果以x±sd表示。

2 结果与分析

2.1 桂花酒浸提工艺的单因素试验结果

2.1.1 桂花酒浸提酒精度的单因素试验结果不同酒精度对桂花酒的影响结果见图1。

图1 不同酒精度对桂花酒的影响Fig.1 The influence of different wine base’s alcohol degrees on osmanthus wine

由图1可知，桂花总黄酮提取率基本随着酒精度提高而增加，但是酒精度在70%vol时，桂花酒的感官评价由于较高的酒精度导致下降。因此在其他条件相同下，选择加入酒精度为60%vol的原酒浸提具有较高的黄酮提取率和感官评价得分。

2.1.2 桂花酒浸提温度的单因素试验结果

不同浸提温度对桂花酒的影响如图2所示。

图2 不同浸提温度对桂花酒的影响Fig.2 Effects of different extraction temperature on osmanthus wine

由图2可知，桂花总黄酮的提取率和桂花酒的感官评价基本随着浸提温度的升高而升高，但在75℃～85℃下提升幅度明显减缓。因此在其他条件相同的情况下，75℃和85℃条件下感官评价得分相同，而85℃条件下，黄酮提取率略高于75℃，但从经济条件下考虑，选择75℃浸提可能更符合生产需求。

2.1.3 桂花酒浸提时间的单因素试验结果

不同浸提时间对桂花酒的影响如图3所示。

图3 不同浸提时间对桂花酒的影响Fig.3 Effects of different extraction time on osmanthus wine

由图3可知，桂花总黄酮的提取率在2 h之后明显减缓，说明桂花总黄酮的提取在2 h基本完成，并且桂花酒的感官评价在2 h之后，也无太大变化。因此在其他条件相同的情况下，在2 h后感官评价得分基本不变，而黄酮提取率略微上升的情况下，综合经济因素，选择2 h浸提更加符合生产需求。

2.2 桂花酒的浸提工艺的正交试验分析

2.2.1 正交试验水平因素的确定

根据上述单因素试验分析，选取酒精度中40%、50%、60%vol，浸提温度 65、75、85℃，浸提时间 1、2、3h，以黄酮提取率及桂花酒成品感官评价为变量，进行三水平三因素的正交试验。正交试验表如表2所示。

表2 桂花酒浸提工艺正交试验因素水平表Table 2 Osmanthus wine extraction process orthogonal test factor level table

2.2.2 浸提工艺正交试验结果

桂花酒浸提工艺正交试验结果见表3，桂花酒的浸提工艺优化的正交试验结果分析见表4，方差分析见表5。

由表4可知，影响桂花酒原酒浸提工艺的黄酮提取率的主次因素依次为：C＞B＞A，即浸提时间＞浸提温度＞酒精度；影响桂花酒原酒浸提工艺的感官评价的主次因素依次为：C＞B＞A，即浸提时间＞浸提温度＞酒精度。由表5可知，浸提时间对桂花酒原酒的总黄酮提取率有极显著影响，浸提温度和酒精度对黄酮提取率有显著影响，3个因素对桂花酒的感官评价没有较大影响。综合表4及表5，选择原酒酒精度为60%vol，浸提温度为85℃，浸提时间2 h。根据表4中浸提温度对于提取率及感官评价的k2值与k3值的比较，及对经济效率的考虑，选择在75℃条件下浸提更加合适。经过试验验证，在酒精度为60%vol，浸提温度为75℃，浸提时间2 h时，其提取率在93.21%，感官得分在94.9分，而原酒酒精度为60%vol，浸提温度为85℃，浸提时间2 h的提取率95.33%，感官得分在96.1分，相比之下提高水平并不多，因此选择前者更符合生产需求，即原酒酒精度为60%vol，浸提温度为75℃，浸提时间2 h。

表3 桂花酒浸提工艺正交试验方案及试验结果Table 3 The orthogonal test scheme and test results of osmanthus wine extracting process

表4 桂花酒浸提工艺正交试验结果分析Table 4 Analysis of orthogonal test results of extraction process of osmanthus wine

表5 桂花酒浸提工艺正交试验结果方差分析Table 5 Analysis ofvariance analysis of orthogonal test results of osmanthus wine extracting process

2.3 桂花酒抗氧化能力试验结果

2.3.1 桂花酒原酒及桂花酒成品酒的黄酮含量

桂花酒的黄酮含量见表6。

表6 桂花酒的黄酮含量Table 6 The flavonoids content of osmanthus wine

以芦丁为标准品，对桂花提取液，桂花酒原酒及桂花酒成品酒，测定其总黄酮含量。从表6可知桂花中含有大量的总黄酮类物质，经提取后具有较高的纯度和活性。提取物经原酒溶解后，黄酮浓度具有较高水平，调配后的成品酒也有较高的黄酮含量。

2.3.2 桂花酒对DPPH自由基的清除能力

桂花酒对DPPH自由基清除能力试验结果见图4。

图4 桂花酒对DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging capacity of osmanthus wine

DPPH自由基清除能力测试，是一种快速、简单的对自由基清除剂的筛选和判别方法。其原理是DPPH乙醇溶液呈紫色，当有自由基清除剂存在时，由于自由基与自由基清除剂进行单电子配对，紫色减褪，其褪色程度符合朗伯比尔定律[21]。

如图4可知，4种物质对DPPH自由基的清除能力趋势基本相同，都是随着总黄酮的质量浓度增加，对DPPH自由基的清除能力上升。通过计算4种物质的 IC50值，VC的 IC50为 35.92 mg/L，BHT 的 IC50为60.49 mg/L，桂花提取液（质量浓度以总黄酮质量浓度计）的IC50为52.44 mg/L，桂花酒成品（质量浓度以总黄酮质量浓度计）的IC50为48.82 mg/L，因此对DPPH自由基的清除能力的强弱顺序为VC＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

2.3.3 桂花酒对羟基自由基的清除能力

桂花酒对·OH清除能力试验结果见图5。

图5 桂花酒对·OH清除能力Fig.5 The hydroxyl radical scavenging ability of osmanthus wine

·OH是一种活性氧自由基，具有极强的氧化性，并且能与抗氧化剂迅速反应，在人体内也发现会产生少量的·OH，会对人体细胞造成损伤[22]。

从图5分析可知：在质量浓度均为20 mg/L～40 mg/L时，其他3种物质对·OH清除能力均大于VC，其中桂花酒成品具有最强的清除效果；但在80 mg/L～100 mg/L质量浓度下，VC比其他3种物质的清除能力强；4种物质对·OH的清除效果基本呈现出随着质量浓度的增加而递增的趋势，对4种物质的IC50进行计算，BHT的IC50值为51.25 mg/L，桂花提取液（质量浓度以总黄酮质量浓度计）的IC50值为48.02 mg/L，桂花酒成品（质量浓度以总黄酮质量浓度计）的IC50值为44.77 mg/L，VC的 IC50值为 51.64 mg/L，依照 IC50值来判断，抗氧化能力强弱为：桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT＞VC，但是在不同质量浓度下每个物质对·OH清除能力有所区别，并不是线性的。

2.3.4 桂花酒对超氧阴离子自由基的清除能力

桂花酒对O2-·清除能力见图6。

图6 桂花酒对O2－·清除能力Fig.6 Superoxide anion radical scavenging ability of osmanthus wine

O2-·是人体内产生的一种活性自由基，正常情况下，会与人体内细胞中如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等物质进行反应，被除掉，达到机体内的平衡。当这种平衡失去时，O2-·会在人体内积累，而机体的抗氧化酶类活性下降，此时O2-·会对人体的细胞造成损伤[23]。

根据图6数据显示：4种物质对O2-·的清除能力基本随着质量浓度增大而增加，桂花提取液和桂花酒成品（质量浓度以总黄酮质量浓度计）远远小于VC的清除能力，但比BHT的清除能力强。通过计算4种物质的IC50值，得到VC的IC50值为79.39 mg/L，桂花酒成品的IC50值为123.91 mg/L，桂花提取液的IC50值为136.87 mg/L，BHT 的 IC50值为 168.83 mg/L，即对 O2-·的清除能力强弱顺序为VC＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

3 结论

新型桂花酒采用植物功效成分提取技术，对桂花中的活性成分如黄酮等物质进行提取，得到具有较高纯度的桂花提取物，然后加入原酒对桂花提取物进行提取。本文主要针对桂花提取物的浸提工艺进行优化，首先进行单因素试验对不同因素进行分析，结合单因素试验结果，进行正交试验对浸提条件进行优选，综合总黄酮提取率，桂花酒的感官评价及经济因素，选取酒精度为60%vol的原酒在75℃下浸提2 h，经重复验证，具有较好的提取效果，且经过调配后的桂花酒成品，具有优良的感官特性，符合目前市场上对于健康的需求。

目前生产的新型桂花酒缺点在于经过多次分离纯化后，部分香气成分物质可能析出，因此如果能够解决新型桂花酒的香气损失问题，就能够生产出健康及风味俱佳的桂花酒。针对新型桂花酒的研发工作，对桂花中活性物质及香味成分物质分析至关重要。目前国内已经有机构或者公司对桂花香味物质进行研究，并且通过超临界萃取、微波蒸馏萃取等技术进行提取，制成桂花香氛[24-25]，因此针对新型桂花酒的香气缺失问题，如果向其中加入天然生产的桂花香氛，可能会解决此问题，但其他影响尚且未知，需要通过之后的研究探讨其效果。