微波辅助提取山竹壳中的总黄酮及其体外抗氧化活性研究

2019-02-16姚新鼎姜飞燕王玉伟袁岐山

食品研究与开发 2019年4期

姚新鼎，姜飞燕，王玉伟，袁岐山

（1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475004；2.开封市绿色涂层材料重点实验室，河南开封475004；3.河南中烟工业有限责任公司，河南郑州450000）

山竹学名莽吉柿，双子叶植物，具有极高的药用价值。山竹中的成分对多种病症效果显著，如腹痛、腹泻、感染性创伤、慢性溃疡等疾病的治疗。山竹不但具备抗氧化能力，也有助增进免疫系统健康[1]。

总黄酮提取方法有双水相提取法、大孔树脂吸附法、半仿生提取法、超声提取法、微波辅助提取法等[2]。双水相提取法分相快，易操作，提取率高，但成本较高[3-4]；大孔树脂吸附法选择性好，吸附速度快，但操作复杂，工艺要求较高[5-6]；半仿生提取法生产周期短，成本低，但提取效果较差[7-8]；超声法提取操作简单、速度快、消耗小，但总黄酮提取纯度较低[9-10]；微波辅助提取法具有操作时间短、消耗少、效率高、污染小等特点[11-12]。因此本试验利用微波辅助法探讨山竹壳中总黄酮的提取工艺，为山竹的进一步研究提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山竹：广西省玉林市；氢氧化钠（分析纯）：上海德榜化工有限公司；硝酸铝（分析纯）：廊坊市鹏彩精细化工有限公司；过氧化氢（分析纯）：德州润昕实验仪器有限公司；硫酸亚铁（分析纯）：北京康普汇维科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：杭州富强化工有限公司；芦丁标准品（色谱纯）：中国药品生物制品鉴定所本试验所；1，1-二基-2-苦基肼自由基（DPPH）（分析纯）：苏州亚科科技股份有限公司。

1.2 样品预处理

将山竹壳洗净、风干后切成片状，放在烘箱中干燥至质量恒定，研磨并过筛，置于棕色瓶备用。

1.3 仪器与设备

DHG-9070B型电热鼓风干燥箱：山东博科生物产业有限公司；FW-400A型高速万能粉碎机：上海沪粤明科学仪器有限公司；SECURA 1103-1CEU大量程精密天平：广州市深华生物有限公司；XO-SM100型超声微波组合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；KL05RF低速离心机：重庆誉岭科技有限公司；DL-1209型紫外可见分光光度计：厦门德量检测仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微波辅助提取

参照崔鹏等[13-15]的方法，取适量的样品，加入乙醇溶解后静置20 min，在适当功率和提取时间下，制得待测液。进行多次平行试验，取算术平均值。

1.4.2 芦丁标准溶液的制备与标线的绘制

准确称取芦丁标准品0.020 0 g，用少量30%的乙醇溶解，转移定容至100 mL容量瓶，溶液浓度为0.20 mg/mL。标线的绘制：用移液管分别移取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的芦丁标准溶液于 10 mL 的比色管中，依次加入适量体积的亚硝酸钠、亚硝酸铝、氢氧化钠溶液，并用30%的乙醇定容，摇匀后静置20 min。测定（505 nm）吸光度值。山竹壳中总黄酮质量浓度计算公式如下：

式中：Y为样品中总黄酮提取率，mg/g；C为山竹壳中总黄酮类化合物的质量浓度，mg/mL；V1为稀释体积，mL；V2为样品溶液体积，mL；m 为样品质量，mg；V3为取样体积，mL。

1.4.3 标准曲线

横坐标（X）为芦丁质量浓度，纵坐标（Y）为吸光度值，绘制芦丁标线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

由图1可知，芦丁标线为Y=9.324 3X+0.000 6，相关系数为R2=0.999 6。该标线在0～0.01 mg/mL范围内呈良好线性关系。

1.4.4 山竹壳中总黄酮的提取单因素试验

分别以液料比、乙醇体积分数、微波提取时间、微波功率为影响因素，设置4个因素的不同水平，分析不同提取条件对山竹壳中总黄酮提取率的影响。

1.4.5 正交优化试验设计

根据单因素试验结果，设计四因素四水平正交试验，水平因素表见表1。

表1 水平因素表Table 1 Table of levels and factors

2 山竹壳中总黄酮抗氧化试验

2.1 超氧阴离子自由基的清除

参照林海禄等[16-17]方法，测定超氧阴离子自由基清除率。取不同体积分数样品液1.00 mL，各加入4.50 mL Tris-HCl缓冲液和0.10 mL邻苯三酚，反应5 min后加入1.00 mL HCl溶液终止反应，混匀，以蒸馏水作参比，测定（299 nm）吸光度值。超氧阴离子自由基清除率公式为：

式中：A1为样品液和含邻苯三酚溶液的吸光度值；A2为不含邻苯三酚溶液样品液的吸光度值；A3为含邻苯三酚溶液的吸光度值。

2.2 DPPH自由基的去除

参照孙建华等[18-21]方法，采用DPPH自由基测定山竹壳的抗氧化效果。配制浓度是0.20 mg/mL DPPH溶液，低温阴凉处保存。取不同浓度的样品2.00 mL，加入DPPH溶液，混匀，在暗处反应30 min左右。以无水乙醇做参比，测定（515 nm）吸光度值。去除率公式为：

式中：Ai为DPPH溶液吸光度值；Ax为样品液和DPPH溶液吸光度值；Ae为不含DPPH溶液时样品液吸光度值。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果分析

参照王彦平等[22]方法，采用origin8.0软件对试验数据制图，单因素试验结果进行分析。

3.1.1 液料比对山竹壳中总黄酮提取率的影响

液料比对山竹壳中总黄酮提取率的影响见图2。

图2 液料比对山竹壳中总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid ratio on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由图 2 知，液料比在 30∶1（mL/g）之前，30∶1（mL/g）之后随提取率的上升而下降。液料比为30∶1（mL/g）时，提取率最高。推测可能是样品吸水充分溶胀，与溶剂的接触面积增加，导致总黄酮的提取率有所上升。因此，液料比选择 30∶1（mL/g）。

3.1.2 乙醇体积分数对山竹壳中总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对山竹壳中总黄酮提取率的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对山竹壳中总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of concentration of ethanol on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由图3知，提取率随乙醇体积分数的增大而先上升后下降，当乙醇体积分数为75%时，提取率最高，提取率降低的原因可能是乙醇体积分数过高，不利于总黄酮类物质的溶解。此外，当乙醇体积分数过高时，会溶出醇溶性的杂质、色素和脂类物质影响总黄酮的提取率。因此，乙醇体积分数选择75%。

3.1.3 微波提取时间对山竹壳中总黄酮提取率的影响

微波辅助提取时间对山竹壳中总黄酮提取率的影响见图4。

图4 微波辅助提取时间对山竹壳中总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction assisted extraction of flavonoids in Mangosteen extract time

由图4知，提取率随提取时间的增加而先上升后下降，提取率在3 min时达到最高，提取率下降的原因是时间的增加，使温度升高，导致乙醇挥发较快。因此，提取时间选择3 min。

3.1.4 微波功率对山竹壳中总黄酮提取率的影响

微波功率对山竹壳中总黄酮提取率的影响见图5。

图5 微波功率对山竹壳中总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction power on the extraction of flavonoids in Mangosteen

由图5知，提取率随微波功率增加而先上升后下降，当微波功率为300 W时，提取率最高，提取率下降的原因可能是乙醇挥发较快，山竹壳中总黄酮物质不能充分被溶解。因此，微波功率选择300 W。

3.2 山竹壳中黄酮提取条件优化正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 山竹壳中总黄酮提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Optimization results of orthogonal test and analysis of extraction conditions of flavonoids in Mangosteen

试验结果显示，总黄酮的提取率受各因素的影响次序：乙醇体积分数（A）＞微波功率（D）＞微波提取时间（B）＞液料比（C）。最佳方案是A1D2C3B2，即乙醇体积分数 75%，微波提取时间 3 min，液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率300 W。该试验条件没有出现在正交试验中，需要进行验证，依照上述试验条件平行3次试验，取算数平均值结果如下：提取率分别是12.05%、12.10%、11.92%，得出山竹壳中总黄酮类物质提取率为12.02%，与正交试验相符合。因此为最佳试验条件，说明此方案可实施性较强。