张蜀艳，蒲建萍，李政

（1.成都工业职业技术学院，四川成都610051；2.四川卫生康复职业学院，四川自贡643000；3.成都市科技发展研究中心，四川成都610051）

白花蛇舌草和半枝莲药物作为一种中药配方，药用价值极高。两者均富含活性多糖、生物碱、黄酮类化合物、甾体皂苷和多酚类等化学物质，而且同时具备清热解毒、消肿化瘀、利尿除湿、消除各类炎症等药理作用[1]。文献证明，白花蛇舌草和半枝莲对于治疗肝癌、胃癌、直肠癌以及鼻咽癌具有较好的功效[2]。黄酮类化合物作为广泛存在于白花蛇舌草和半枝莲中的一类活性药用成分，在防治心脑血管疾病、抗癌抗肿瘤、消除人体自由基等方面具有较好的功效[3]。

目前，关于白花蛇舌草和半枝莲药物应用的研究主要集中于提高免疫力和抗癌抗肿瘤两大方向[4]，但关于白花蛇舌草和半枝莲药物活性成分作用机理的研究鲜有报道。本研究拟通过质量比为1∶1的半枝莲/白花蛇舌草配伍方为试验材料，对其总黄酮类化合物提取条件进行优化研究，从而为进一步探索黄酮类保健食品开发路径奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白花蛇舌草：武汉中药材饮片有限公司；半枝莲：湖北聚瑞中药饮片有限公司。白花蛇舌草与半枝莲均于60℃条件下进行恒温干燥至恒重，冷却至常温后，过50目筛进行粉碎，密封保存备用。

芦丁标准品：北京科兴生物制品有限公司；无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、双氧水、水杨酸、无水乙醇、丙酮、无水乙醚，硫酸亚铁、邻三苯酚（均为分析纯）：上海实验试剂有限公司。

UV1300型紫外可见分光光度计：成都信立邦生物制药有限公司；FA2004B型电子天平：上海精密仪器仪表有限公司；YRE-2050A型旋转蒸发仪：上海玛尼仪器设备有限公司；DFY-200C型高速粉碎机：上海利闻科学仪器有限公司；J-HH-6A型精密数显恒温水浴锅：上海胜卫电子科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作

准确称取芦丁标准品10 mg，将其溶解于70%的乙醇溶液当中，量筒定容至100 mL，此时可获得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。取6个25 mL的容量瓶，分别按照顺序准确加入 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准溶液。之后，分别加入5%的亚硝酸钠溶液1.5 mL，混合均匀，静置6 min；分别加入10%的硝酸铝溶液2 mL，混合均匀，静置6 min；分别加入4%的氢氧化钠溶液2 mL，混合均匀，静置1 min；最后，用70%乙醇溶液定容，混合均匀，静置15 min[5]。将6个样品于510 nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，获得标准曲线的方程为：A=0.189 7C－0.198 6，R2=0.997 9。

1.2.2 试验样品制备及总黄酮得率测定

称取一定质量的白花蛇舌草、半枝莲，粉碎并过40目筛，各取10.0 g，于磨口三角烧瓶中混合均匀，形成试验样品。在超声波清洗器中，按照试验设定的时间进行浸提，过滤除去残留物；滤液在90℃条件下进行旋转蒸发浓缩；以乙醇为溶液，按照试验设定的液固比、乙醇浓度进行醇沉，醇沉1 h；醇沉产物在离心机中，按照4 000 r/min离心处理15 min；离心处理后产物依次采用无水乙醇、丙酮、无水乙醚进行洗涤，每样试剂洗涤3次；将所得滤渣溶解于浓度为70%的乙醇溶液当中，并定容至50 mL，作为待测样品。之后按照1.2.1中所述方法，进行吸光度测定，并按照标准曲线求得总黄酮得率。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 乙醇浓度的确定

固定液固比为70∶1（mL/g）、提取时间为3 h的基础因素条件，研究不同乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对总黄酮得率的影响及变化规律。

1.2.3.2 液固比的确定

固定乙醇浓度为70%、提取时间为3 h的基础因素条件，研究不同液固比[50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1、90∶1（mL/g）]对总黄酮得率的影响及变化规律。

1.2.3.3 提取时间的确定

固定乙醇浓度为70%、液固比为70∶1（mL/g）的基础因素条件，研究不同提取时间（1、2、3、4、5 h）对总黄酮得率的影响及变化规律。

1.2.4 响应面试验设计

以单因素试验结果为基础，进行响应面试验，以乙醇浓度（X1）、液固比（X2）、提取时间（X3）为自变量，总黄酮得率（Y）为响应面值，制定总黄酮提取工艺的三因素三水平响应面法试验设计方案，因素水平表见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.5 抗氧化性研究

1.2.5.1 羟基自由基清除率的测定

取6只试管，分别按照顺序加入12 mol/L的FeSO4溶液、12 mol/L的水杨酸溶液各2 mL。1号试管为对照空白样品，加入2 mL蒸馏水，2号～6号试管分别加入浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黄酮提取液各2 mL，然后在1号～6号试管中加入2 mL浓度为3%的H2O2溶液，用温度为40℃的恒温水浴锅反应25 min，反应结束后，于波长510 nm处，测定吸光度。其中，1号试管计为空白对照样品的吸光度AO，2号～6号试管计为待测溶液样品的吸光度AX。采用同样的方法，将2号～6号试管的H2O2溶液改为蒸馏水，测定吸光度，计为待测溶液样品的底吸光度AXO[6]。羟基自由基清除率计算公式为：

羟基自由基清除率/%=[AO-（AX-AXO）]/AO×100

式中：AO为空白对照样品的吸光度；AX为待测溶液样品的吸光度；AXO为待测溶液样品的底吸光度。1.2.5.2 超氧阴离子自由基清除率的测定

取6只试管，分别加入浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）5 mL，37℃的恒温水浴锅反应20 min。1号试管为对照空白样品，加入2 mL蒸馏水，2号～6 号试管分别加入浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的黄酮提取液各2 mL，然后在1号～6号试管中加入0.5 mL浓度为0.025 mol/L的邻苯三酚溶液，均匀混合后，37℃恒温水浴锅反应6 min，最后加入1 mL 0.1 mol/L的HCl溶液终止反应，于波长320 nm处，测定吸光度。其中，1号试管计为空白对照样品的吸光度AO，2号～6号试管计为待测溶液样品的吸光度AX[7]。超氧阴离子自由基清除率计算公式为：

超氧阴离子自由基清除率/%=（AO-AX）/AO×100

1.3 模型构建与数据分析

利用Design-expert8.0软件进行响应面法回归模型的构建以及模型结果的分析[8]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

乙醇浓度对总黄酮得率的影响见图1。

通过图1分析发现，在乙醇浓度为50%～70%的范围内，总黄酮得率随着乙醇浓度的升高而增加；在乙醇浓度为70%～90%的范围内，总黄酮得率随着乙醇浓度的升高呈现出下降的趋势。出现这样的变化趋势主要是因为当乙醇浓度过低时，黄酮类物质容易提取不充分，而当乙醇浓度过高时，黄酮类物质提取趋于饱和，从而使得总黄酮得率出现下降[9]。在乙醇浓度试验设定范围内，当乙醇浓度为70%时，总黄酮得率达到最高，为6.85%。因此，在响应面法试验设计方案中，乙醇浓度的基量水平应当为70%为宜。

图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2.1.2 液固比对总黄酮得率的影响

液固比对总黄酮得率的影响见图2。

图2 液固比对总黄酮得率的影响Fig.2 The effect of ratio of liquid to solid on the yield of total flavonoids

通过图2分析发现，在液固比为50∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）的范围内，总黄酮得率随着液固比的增加而增加；在液固比为 60 ∶1（mL/g）～90 ∶1（mL/g）的范围内，总黄酮得率随着液固比的增加而缓慢下降。出现这样的变化趋势可能是因为提取的黄酮类物质会在液固比60∶1（mL/g）的情况下达到饱和状态，如果进一步增大液固比会稀释提取的黄酮类物质的浓度，从而造成总黄酮得率的下降[10]。在液固比试验设定范围内，当液固比为60∶1（mL/g）时，总黄酮得率达到最高，为6.62%。因此，在响应面法试验设计方案中，液固比的基量水平应当为60∶1（mL/g）为宜。

2.1.3 浸提时间对总黄酮得率的影响

浸提时间对总黄酮得率的影响见图3。

通过图3分析发现，在浸提时间为2 h～4 h的范围内，总黄酮得率随着浸提时间的延长而增加；在浸提时间为4 h～5 h的范围内，总黄酮得率随着浸提时间的延长而缓慢下降。通常情况下，总黄酮得率与浸提时间之间会存在一个时间平衡点，而低于或超出这个时间平衡点，都会导致总黄酮得率的下降[11]。在浸提时间试验设定范围内，当浸提时间为4 h时，总黄酮得率达到最高，为6.59%。因此，在响应面法试验设计方案中，浸提时间的基量水平应当为4 h为宜。

图3 浸提时间对总黄酮得率的影响Fig.3 The effect of extraction time on the yield of total flavonoids

2.2 响应面工艺参数优化试验

2.2.1 优化试验方案

依据单因素试验结果，进行响应面法试验设计。响应面试验设计组合及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计组合及结果Table 2 Design combination and result of response surface test

2.2.2 回归模型构建与方差分析

以乙醇浓度（X1）、液固比（X2）以及浸提时间（X3）为响应面试验设计基本参数，研究不同试验因素组合对总黄酮得率（Y）的影响及其变化规律。表2已显示出不同试验因素组合条件下的总黄酮得率。回归方程的方差分析见表3。

回归方程为：

表3 回归方程的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3回归方程的方差结果可知，F失拟=0.55＜F0.05（3，4）=6.59，说明响应面法所建立的回归方程失拟项不显著，回归方程可用于最优试验结果的选择。同时，回归方程的p＜0.000 1，说明回归模型的F值表现为极显著，即试验数据与所采用的回归方程模型预测结果基本相符[12]。回归方程的偏回归系数检验见表4。

表4 回归方程的偏回归系数检验结果Table 4 Test result of partial regression coefficient of regression equation

对表4回归方程的偏回归系数检验的结果进行分析，可以得出如下结论：在3个试验因素的一次项中，X1、X2、X3与Y均呈正相关，并且对Y的影响呈现出极显著水平（p＜0.01）。在3个试验因素的二次项中，X32与Y呈正相关；X12、X22与Y呈负相关。同时，3个试验因素的二次项对Y的影响均呈现出极显著水平（p＜0.01）。在3个试验因素的交互项中，X1X3、X2X3与Y呈正相关；X1X2与Y呈负相关。其中，X1X2、X2X3对Y的影响呈现出极显著水平（p＜0.01）；X1X3对Y的影响不显著。

三因素之间两两交互作用的响应面图和等高线图见图 4、图 5、图 6。

从这3张响应面图的等高线分布情况以及极值点出现情况可以看出，在3个试验因素交互作用中存在理论上的极值[13]。对比3张响应面图中的3D曲线陡峭程度可知，X1与X2交互作用的3D曲线陡峭程度最为突出，这就表明，X1与X2的交互项对Y的影响相对于其它交互项的影响而言，更为显著。同时，3张响应面图3D曲线陡峭程度也与表4中交互项的方差分析结果相一致。

图4 乙醇浓度与液固比的响应面和等高线分析图Fig.4 The analysis diagram of the response surface and contour line between ethanol concentration and ratio of liquid to solid

图5 乙醇浓度与浸提时间的响应面和等高线分析图Fig.5 The analysis diagram of the response surface and contour line between ethanol concentration and extraction time

图6 液固比与浸提时间的响应面和等高线分析图Fig.6 The analysis diagram of the response surface and contour line between ratio of liquid to solid and extraction time

2.2.3 最优试验因素参数组合选择与验证试验

利用Design-expert软件包的极值分析工具对回归方程进行分析，由此可以获得回归方程极值点所对应的试验因素组合，即乙醇浓度73.92%、液固比70 ∶1（mL/g）、浸提时间 5 h，此时总黄酮得率能够取得理论上的最大值7.33%。考虑到试验的实际可操作性，最佳的试验因素组合取值应为：乙醇浓度74%、液固比 70 ∶1（mL/g）、浸提时间 5 h。

用最佳的试验因素组合进行3次验证试验，分别测定所得样品的总黄酮得率，3个样品的总黄酮得率平均值为7.26%。理论上的总黄酮得率最大值为7.33%，实际获得值与理论最大值的相对误差为0.96%，在试验误差允许的范围之内，说明回归方程拟合度较高，其最优试验因素参数组合选择较为准确[14]。

2.3 黄酮提取物抗氧化性试验

2.3.1 羟基自由基清除试验

黄酮提取液对羟基自由基的清除率结果见图7。

图7 黄酮提取液对羟基自由基的清除率Fig.7 Flavonoid extract on hydroxyl radical scavenging rate

羟基自由基氧化活性很强，会对人体细胞造成很大的危害，从而致使多种疾病的产生[15]。从图7可以看出，在黄酮提取液质量浓度为0.1 mg/mL～0.4 mg/mL的范围时，黄酮提取液对羟基自由基的清除率随着总黄酮提取液质量浓度的提升而增加，之后在黄酮提取液质量浓度为0.4 mg/mL～0.5 mg/mL的范围时，黄酮提取液对羟基自由基的清除率略微下降。当黄酮提取液质量浓度为0.4 mg/mL时，黄酮提取液对羟基自由基的清除率达到最高，为57.16%。

2.3.2 超氧阴离子自由基清除试验

黄酮提取液对超氧离子自由基的清除率结果见图8。

尽管超氧阴离子自由基是人体内存在的一种相对较弱的氧化剂，但它仍然会因为破坏人体细胞中的DNA和细胞膜而导致人体机体受损[16]。从图8可以看出，在黄酮提取液质量浓度为0.1 mg/mL～0.3 mg/mL的范围时，黄酮提取液对超氧离子自由基的清除率随着黄酮提取液质量浓度的提升而增加，之后在黄酮提取液质量浓度为0.3 mg/mL～0.5 mg/mL的范围时，黄酮提取液对超氧离子自由基的清除率呈下降趋势。当黄酮提取液质量浓度为0.3 mg/mL时，黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除率达到最高，为63.89%。

图8 黄酮提取液对超氧离子自由基的清除率Fig.8 Flavonoid extract on superoxide anion radical scavenging rate

3 结论与讨论

获得较高总黄酮得率的最佳试验因素参数组合为：乙醇浓度 74%、液固比 70∶1（mL/g）、浸提时间 5 h。在此条件下得到总黄酮得率的理论值为7.33%。通过验证试验测得实际总黄酮得率为7.26%，实际获得值与理论最大值的相对误差为0.96%，表明回归方程结果可信，最优试验因素组合选择较为准确。

对提取的白花蛇舌草和半枝莲中的黄酮类物质进行抗氧化性试验发现，提取后的黄酮类物质对羟基自由基以及超氧阴离子自由基均具有较强的清除能力。其中，当黄酮提取液质量浓度为0.4 mg/mL时，黄酮提取液对羟基自由基的清除率达到最高，为57.16%；当黄酮提取液质量浓度为0.3 mg/mL时，黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除率达到最高，为63.89%。陈红梅等[17]在研究超声波辅助提取半枝莲中的黄酮类物质抗氧化性时，指出半枝莲中的黄酮类物质具有较强的还原力和羟基自由基清除效果。本试验研究证明，经过提取的白花蛇舌草和半枝莲中的黄酮类糖依然具有较强的抗氧化性，这进一步拓展了白花蛇舌草和半枝莲中黄酮类物质的应用方向。