陈曦，张黎，罗建红，刘林昌，刘义武，黄辉

（内江师范学院化学化工学院，四川内江641199）

洋葱是一种独特的辛辣食物，具有非常复杂的营养成分。洋葱的黄酮醇、槲皮素和槲皮素衍生物是许多国家膳食类黄酮的主要来源之一，作为食品成分、抗氧化剂和抗褐变生物活性化合物来源具有较好的发展潜力[1-3]。多糖是洋葱的主要活性物质之一，洋葱多糖是α-糖苷键连接单糖的多聚物，其纯度及结构直接影响生物活性，是洋葱多糖研究的重点[4]。洋葱多糖具有抗肿瘤、降血脂、降血糖和抗衰老等功能，成为近年来研究热点[1-7]。

提取方法会影响洋葱多糖的纯度和结构，进而影响其生物活性。不同提取液连续提取也使洋葱多糖中不同单糖的含量不同，醋酸钠缓冲液提取多糖中甘露糖含量达81.68%，醋酸钠缓冲液加入草酸铵和乙二胺四乙酸二钠螯合剂提取的多糖半乳糖含量为67.59%[3]。洋葱多糖的提取方法有热水提取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法和超临界流体萃取法等[2，4]。酶解反应条件温和，提高多糖收率，同时也减少蛋白质含量。采用酶辅助提取法还能最大限度地保留洋葱多糖的生物活性，并降低提取成本[8-9]。周文俊等[7]研究了酶法提取洋葱多糖及其抗氧化性，傅东和等[10]研究了纤维素酶提取洋葱多糖的工艺，李健凤等[11]研究了复合酶法提取洋葱多糖，均表明酶辅助提取提高了多糖收率。洋葱多糖的提取基本上都有利用Sewage（氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1）法脱蛋白这一步[2，7]。张强等[12]认为洋葱多糖脱蛋白的最佳方法是胰蛋白酶+Sewage法。酶法能减少蛋白质含量，适合的酶组合可以进一步降低蛋白质含量，从而省略Sewage法脱蛋白这一步，因此可以简化提取工艺。本文以纤维素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶组成复合酶，探究洋葱多糖的最佳提取条件，利用植物蛋白酶的稳定性，复合酶的高效性，缩短工艺周期，降低成本，高效地提取洋葱多糖，使酶法提取多糖技术进一步成熟。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

本地产的新鲜成熟洋葱。

1.1.2 试剂

纤维素酶（1 800 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）（均为生物试剂）：上海金穗生物科技有限公司；磷酸氢二钠、柠檬酸、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醚、苯酚、丙酮、无水乙醇（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9140A电热鼓风干燥机：成都鑫益仪器有限公司；TDL-5-A台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-82型水浴恒温振荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂；T6新世纪紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 洋葱多糖提取

1.3.1 洋葱原料的处理

将购置的新鲜洋葱切碎，40℃干燥，粉碎，备用。称取50 g洋葱粉末于250 mL三角瓶中，再向内加入200 mL 80%乙醇，85℃回流脱脂2.5 h，2次，40℃干燥。

1.3.2 洋葱多糖的提取

参考文献[13-14]的提取方法，略微修改。称取洋葱粉末2.000 g，置于250 mL烧杯中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，取一定量纤维素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶按质量比2∶2∶1比例混合的复合酶制剂，将其加入到洋葱溶液中，在恒温振荡器上酶解一定时间，沸水浴中灭酶15 min，离心。在上清液中，加入3倍体积的85%乙醇，4℃静置过夜。离心，沉淀依次用无水乙醇，无水乙醚，丙酮洗涤，40℃干燥，得洋葱多糖粗产品。

1.4 正交试验设计

在单因素试验基础上，设计L16（45）正交试验（见表1），以洋葱多糖收率和纯度为评价标准，确定最佳工艺。

表1L16（45）正交试验因素与水平设计Table 1Factors and levels of L16（45）orthogonal design

1.5 洋葱多糖的测定[15-16]

准确称取烘干的洋葱多糖粗产品0.010 g，配制成100 μg/mL样品溶液。在25 mL比色管中加入2.00 mL样品，4.00 mL水，2.00 mL 6%苯酚溶液，摇匀，再加入10.00 mL浓硫酸，摇匀，冷却后40℃加热30 min，冷却，测定490 nm的吸光度。

洋葱多糖收率X计算方法

洋葱多糖纯度Y计算方法：

式（1）中：m为提取到的粗品洋葱多糖质量，g；M是洋葱原料质量，g；Y为洋葱多糖纯度。

式（2）中：m为称取的粗品洋葱多糖质量，g；C为测定出来的多糖浓度，μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

准确称取葡萄糖标准品0.100 0 g溶于1 000 mL容量瓶，配制成100 μg/mL标准溶液。避光保存。采用苯酚硫酸法[15-16]，准确移取葡萄糖标准溶液0.80、1.60、2.40、3.20、3.60 mL，分别置于 25 mL 比色管中，并分别用去离子水补至4.00 mL，再加入2.00 mL 6%的苯酚溶液，摇匀，加入10.00 mL浓硫酸，摇匀，冷却后40℃加热30 min，冷却，以去离子水作空白，测定490 nm的吸光度，得回归方程：A=0.042 38×C-0.0522 4，R=0.999 8。式中：A为吸光度；C为溶液中葡萄糖浓度。

2.2 复合酶比例确定

控制pH值6.0，酶解温度55℃，酶解时间90 min，料液比1∶40（g/mL），考察纤维素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶分别加入0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%时洋葱多糖收率和纯度。结果表明：当分别加入纤维素酶0.2%，木瓜蛋白酶0.2%，中性蛋白酶0.1%时洋葱多糖纯度最佳，分别为：54.53%、45.36%、62.36%。所以复合酶最佳配比为纤维素酶∶木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶2∶1。

2.3 单因素对洋葱多糖提取的影响

2.3.1 酶浓度的影响

控制pH值6.0，酶解温度55℃，酶解时间90 min，料液比1∶40（g/mL），考察复合酶加入量分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%时洋葱多糖收率与纯度。图1为酶浓度对洋葱多糖收率与纯度的影响。

图1 酶浓度的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration

洋葱多糖的收率和纯度都随着酶浓度的增加先升高后降低，当酶浓度0.4%时收率和纯度最高。这可能是因为酶浓度较低时，洋葱酶解不充分，多糖收率、纯度较低；而酶用量较高时，洋葱多糖中的某些多糖会被过量的酶分解[7，13]，部分纤维素被纤维素酶分解成可以溶于水的小分子碎片，从而导致洋葱多糖的得率和纯度下降。综合收率和纯度来看，洋葱多糖提取的最佳酶浓度0.4%，此时洋葱多糖收率14.44%，纯度60.22%。

2.3.2 pH值的影响

控制酶浓度0.4%，酶解温度55℃，酶解时间90 min，料液比1∶40（g/mL），考察酶解pH值分别为5.0，5.5，6.0，6.5和7.0时对洋葱多糖的收率和纯度的影响，如图2所示。

图2 pH值的影响Fig.2 Effect of pH

结果表明：洋葱多糖的收率和纯度随着pH值的增大先升高后降低，在pH6.0时得到最大值。每种酶都有最适pH值，在该pH值下催化反应的速率最高[13]。几种酶在微酸性条件下，活性较佳，最佳pH6.0，此时洋葱多糖收率12.46%，纯度60.91%。

2.3.3 料液比的影响

控制pH值6.0，酶浓度0.4%，酶解温度55℃，酶解时间90 min，考察酶解时料液比分别为1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）时料液比对洋葱多糖的收率和纯度的影响，如图3所示。

结果表明：洋葱多糖的收率随着料液比的增大先升高后降低，在料液比1∶40（g/mL）时得到最大值，洋葱多糖的纯度随着料液比的增大而逐渐减小。随着提取液体积增加，有利于多糖扩散，但增加到一定量后，酶浓度低于最佳浓度，使多糖收率、纯度降低。最佳料液比1∶40（g/mL），此时洋葱多糖收率12.60%，纯度66.60%。

2.3.4 酶解时间的影响

控制pH值6.0，酶浓度0.4%，酶解温度55℃，料液比 1 ∶40（g/mL），考察酶解时间分别为 60、90、120、150、180 min时对洋葱多糖的收率和纯度的影响。图4为酶解时间对洋葱多糖的收率和纯度的影响。

图3 料液比的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio

图4 酶解时间的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time

洋葱多糖的收率随着酶解时间的增加先下降后逐渐升高，而纯度则是随着酶解时间的增加逐渐降低。随着酶解时间的延长，酶解作用越完全，但是时间过长会导致部分洋葱多糖分解而使得纯度降低。综合收率和纯度来看，酶解时间选择60 min，此时洋葱多糖收率15.69%，纯度76.26%。

2.3.5 酶解温度的影响

控制pH值6.0，酶浓度0.4%，酶解时间60 min，料液比1∶40（g/mL），考察酶解温度分别为45、50、55、60、65℃时对洋葱多糖的收率和纯度的影响。图5为酶解温度对洋葱多糖收率和纯度的影响。

由图5可知：洋葱多糖的纯度随着温度的升高先逐渐升高而后逐渐下降，而收率在55℃前变化不明显。因为温度对酶解反应和分子扩散都有影响：在温度较低时，升高温度既可使酶和多糖活性物质运动速度提高，有利于扩散，还能提供酶解反应所需能量，促进酶解反应，使酶解作用加强[13]，洋葱多糖纯度增加；当温度高于酶解最佳温度，酶的活性下降，且可能有部分多糖分解[11]，造成洋葱多糖的纯度降低。综合收率和纯度来看，洋葱多糖的最佳酶解温度55℃，此时洋葱多糖收率19.13%，纯度76.83%。

图5 酶解温度的影响Fig.5 Effect of enzymolysis temperature

2.4 正交试验

选择酶解时间、酶浓度、酶解温度、pH值、料液比5个因素进行正交试验，研究不同因素间的交叉影响，试验结果和极差分析结果见表2。

表2 正交试验结果分析Table 2 Result analysis of orthogonal experimental

通过正交试验结果的极差分析（表2）判断复合酶提取洋葱多糖中各单因素对多糖收率和纯度影响的重要性。由表2可知影响洋葱多糖收率的重要性为：B（酶浓度）＞C（酶解温度）＞A（酶解时间）＞E（料液比）＞D（pH值）。洋葱多糖收率的最优组合为A3B4C2D3E4，即最佳组合条件为复合酶用量为0.5%，酶解时间为75 min，酶解温度为50℃，缓冲溶液pH为6.0，料液比为 1 ∶45（g/mL）；影响洋葱多糖纯度的重要性为：D（pH值）＞B（酶浓度）＞A（酶解时间）＞C（酶解温度）＞E（料液比）。洋葱多糖收率的最优组合为A1B2C1D3E4，即最佳组合条件为复合酶用量为0.3%，酶解时间为45min，酶解温度为45℃，缓冲溶液pH值为6.0，料液比为1∶45（g/mL）。综合考虑提取成本，复合酶提取洋葱多糖的最佳试验条件选择复合酶用量为0.3%，酶解时间为75 min，酶解温度为50℃，缓冲溶液pH值为6.0，料液比为 1∶35（g/mL）。

2.5 验证试验

准确称取3份10.00 g洋葱粉末，在最佳工艺条件下提取洋葱多糖，并分析其纯度，得出收率为18.75%（2.00 g洋葱粉末收率为15.24%略高于正交试验结果），标准偏差（SD）为 0.003 74，相对标准偏差（RSD）为1.99%；纯度达62.00%，SD为0.020 5，RSD为1.89%。收率高于正交试验结果，偏差小，说明该工艺是最佳工艺，并且此工艺重现性好，工艺稳定性高。

3 结论

本试验以纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按质量比2∶2∶1混合作为复合酶，通过单因素试验与正交试验优化复合酶提取洋葱多糖的工艺条件，确定复合酶提取洋葱多糖最佳工艺：复合酶用量0.3%，酶解温度50℃，酶解时间75 min，缓冲溶液pH 6.0，料液比1∶35（g/mL）时，多糖收率18.75%，纯度达62.00%。采用复合酶提取洋葱多糖，可以进一步提高洋葱多糖的收率和纯度，并省略Sewage法脱蛋白，简化提取工艺，且此提取工艺重现性好、稳定性高。用本方法制备的多糖没有进一步纯化，通过纯化提高纯度，活性将更强，应用前景将更广阔。