郭文久，凌君，周云

（1.安康学院秦巴中药资源研究中心，安康学院化学化工学院，陕西安康725000；2.安康学院陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康725000）

天然蜂蜜经蜜蜂采集花蜜之后，再经过蜜蜂自己的口腔肠胃酿造而后存贮在蜂巢中，大多数情况下，蜂农用摇蜜机或者榨蜜机从蜂巢中把蜂蜜分离出来，这种蜂蜜也叫分离蜜[1]。在蜜蜂采集花蜜、花粉、水活动中以及蜂农在蜂群管理、摇蜜或者榨蜜、蜂蜜转运、加工封装等活动中会带入一定的环境微生物，除了嗜渗酵母又叫嗜糖酵母之外，其他微生物基本都是因为蜂蜜含糖量高含水量低的高渗透性而被抑制而不能引起蜂蜜品质的改变[2-3]。但是嗜渗酵母能在蜂蜜的高渗透压的环境中持续繁殖，从而导致蜂蜜发酵产生二氧化碳气体。随着贮藏时间的延长、贮藏温度的升高、蜂蜜含水量的上升，嗜渗酵母的发酵能力进一步增强，不但会产生大量的二氧化碳，也会使蜂蜜变酸，进而使蜂蜜产生变质，从气味上就能嗅到发酵之后的酸味。同时这些二氧化碳气体在贮藏容器处于静止状态时能够溶解于蜂蜜溶液中，但是在运输途中，因为震动就会溢出到包装瓶或者包装桶的液面上，从而对容器产生额外的压力，特别是在夏秋季高温时节，刚收到的蜂蜜快递马上打开包装瓶时就会产生爆裂现象，或者将长久静置的蜂蜜拿到手上而并没有大的震动都会产生溢出或者爆裂。这给蜂蜜的贮运安全性造成较大问题。同时蜂蜜因为发酵后变酸腐败，最后到变质不能食用而成为废品[3]。

按照联合国国际食品法典委员会（CAC）CODEX STAN 12-1981《蜂蜜标准》3.2的要求，蜂蜜是不能加热的，所以就排除了通过巴氏等高温杀菌的可能性。国外有采用伽马射线消毒来解决[4]。而且在众多的国内外蜂蜜质量标准中都一致认为，蜂蜜是不能通过加热来杀菌的[5]。通过查阅文献找到了应用于牛奶和果汁延长货架期的超声波技术来解决这个问题[4]。本研究使用的超声波处理机已经申请了发明专利，通过此专利的一个实例样机处理蜂蜜，依照GB14963-2011《食品安全国家标准蜂蜜》测定了蜂蜜的酵母计数[6]，另外设计了模拟高温贮运后的泡沫产生情况，从外观上观察超声波技术对于蜂蜜中嗜渗酵母的杀菌或抑菌效果，用目视方法观察了这些超声波处理对蜂蜜结晶改变的情况。

1 材料方法

1.1 材料

蜂蜜：陕西省安康市汉滨区恒口镇蜂元蜂产品加工坊，文字商标为蜂养元。蜂蜜为2017年8月由意大利蜂采集的百花蜜。但是由于要证明蜂蜜发酵终止情况，本次购买的是已经有一定程度发酵，带有少许酒味、打算冬季饲喂蜜蜂的蜂蜜，其为38°Bé。

1.2 主要仪器设备

超声波处理机（专利申请号为201711343040.6和201721752538.3）：深圳市科美达超声波设备有限公司；LX-C35型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台：上海仙象仪器仪表有限公司；32G内存iphone 7 plus手机：美国苹果公司；210型显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；SPX-250B-G型恒温箱：上海博讯实业实业有限公司。

1.3 药品与试剂

氯硝胺18%甘油琼脂、微生物培养基添加剂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；丙三醇（分析纯）：天津红岩化学试剂厂试剂厂；葡萄糖（分析纯）：天津化百世工有限公司。

1.4 超声波处理蜂蜜后泡沫产生情况观察

试验使用已经有一定程度发酵的、打算冬天饲喂蜜蜂的蜂蜜作为供试样品。首先，分别取5次样品，每次都取200 mL，设置超声波功率600 W、频率为20 kHz时进行处理。处理时间分别设为 0、1、3、5、7 min，待操作完成后用保鲜膜密封，重复3次上述操作。

将密封好的蜂蜜放入恒温箱中，设置温度为35℃，培养3 d。3 d过后将其取出来模拟快递过程中的震动，对各个烧杯均匀摇动，要确保每一个烧杯摇动的力度和时间基本一致。然后按照气泡数的多少分为0级到5级。没有或者接近于无泡沫记为0级，泡沫极其少的记为1级，泡沫较少记为2级，泡沫常规记为3级，泡沫较多记为4级，泡沫超多记为5级。

1.5 超声波处理后的蜂蜜结晶性质观察

将1.4观察记录完成后，将供试样品放到秦岭以南、巴山以北的汉水流域中游的冬季室温（类似于长江流域中游的气候特征）条件下3个月左右（2017年11月至2018年1月），然后连续观察其结晶情况并记录，如果出现有全部结晶之后就停止观察并记录结果，如果一直不能结晶最长观察3个月终止，记录最后结晶情况。记录标记为0级-无结晶；1级-超低结晶；2级-极少数结晶；3级-较少结晶；4级-较多的结晶；5级-更多的结晶。

试验地点统计了2017年11月～2018年1月历史气象资料结果为：高温平均11℃，极端高温23℃，低温平均2.8℃，极端低温-5℃，相对湿度平均75%。

1.6 嗜渗酵母计数

本试验所用蜂蜜样品与1.4一样，蜂蜜已经有一定程度发酵。每个处理用量筒量取样品250 mL加到超声波处理机中按照设定的条件即频率20 kHz、功率600 W进行超声波处理，处理完后倒入500 mL烧杯中用保鲜膜封口存入冰箱冷藏室备用。超声波处理的时间设定为 0（对照）、3、6、9 min，重复 3 次。

按照GB14963-2011附录A方法的步骤[6]进行酵母培养；按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落综述测定》观察记录并计算酵母计数[7]，单位为 CFU/g。

2 结果

2.1 超声波处理后泡沫观察

为了观察经过短时高温贮运后蜂蜜产生二氧化碳的情况，采用1.4的试验程序观察泡沫产生的情况，经过统计分析后得到图1。

图1 蜂蜜经超声波处理、在恒温箱中经35℃高温培养3 d、摇动后产生泡沫的情况Fig.1 After honey was ultrasonic processed，cultured 3 d in the 35℃high temperature incubator，and shaken，the foam ranks were observed

从图1看出，蜂蜜样品经过超声波处理之后，对照即0 min的泡沫最多，随着超声波处理时间的延长，泡沫等级明显减少，但是到5 min之后泡沫等级趋于稳定，说明超声波处理的作用仅仅在于消除酵母发酵释放的二氧化碳所造成的那部分泡沫，而蜂蜜本身因为含糖及蛋白质所引起的泡沫是不能被超声波处理所消除的。与对照相比，处理5 min和7 min后，泡沫减少了90%以上。试验数据经过单因素完全随机的方差分析之后，其处理间差异达到了极显著。

为了展示图1的超声波消除泡沫的直观情况，随机选取了一个对照和一个7min处理两个烧杯都是500 mL容积，所加蜂蜜均为200 mL，拍摄成照片，结果如图2所示。

图2 超声波处理后蜂蜜产生泡沫差异的对比照片Fig.2 The foam comparative pictures after ultrasonic process

从图2可以看出超声波处理的效果是极其显著的。由于蜂蜜样品本身已经有一定程度的发酵，所以在35℃条件下，恒温培养3 d、再进行摇动后，对照产生的气泡量特别大，而超声波处理7 min，泡沫就明显减少了，说明超声波抑制酵母发酵特别明显而且直观。将图2与图1结合起来更容易理解超声波处理的效果。

2.2 超声波处理后结晶性质的观察

在CAC CODEX STAN 12-1981《蜂蜜标准》的3.1中明确表示化学或者生物化学处理不应当影响蜂蜜的结晶[5]。按照1.5方法观察结晶性质，平均温度2.8℃。试验处理3个月之后，没有能观察到结晶的差异，所以就未做结晶等级的统计记录，结果仅仅进行了拍照，结果见图3。

图3 -2℃～15℃室温存储3个月后的结晶观察结果Fig.3 The results of honey crystallization stored 3 months under room temperature between-2℃and 15℃

从图3看出，没有处理过的（最左边一个烧杯）与 5 s、1、3、5、7 min 一样都没有结晶，目视观察基本无差异。

使用本试验所用的同样的超声波处理机进行了功率为600 W、频率20 kHz、5 min处理时间的生产性试验，所加工的2 t蜂蜜，采用500 g玻璃瓶进行封装，按1.5进行贮存、观察，结果发现，既有结晶的也有没有结晶的。可知生产性试验的蜂蜜原来会结晶的还是会结晶，原来不会结晶的还是不会结晶，说明超声波处理不能改变蜂蜜结晶属性。

2.3 超声波处理后酵母计数结果

采用GB14963-2011附录A方法[6]来测定超声波处理后酵母计数情况，结果见图4。

图4 超声波处理后的酵母计数结果Fig.4 The yeast count results after ultrasonic processes

从图4看出，超声波处理随着处理时间的延长，蜂蜜中的嗜渗酵母得到了较大抑制，到3 min的时候只有原来的38%，6 min之后，酵母计数只有原来的14%，只有186 CFU/g。这个数字已经达到了GB14963-2011[6]的酵母计数小于200 CFU/g的要求了。本试验所用的蜂蜜样品已经有一定程度发酵，蜂蜜溶液里面已经含有较大量的嗜渗酵母，如果采用新鲜的蜂蜜，里面的酵母含量很低，可能观察不到抑菌效果。

比较图1、图2、图4的结果，可以得到超声波处理确实抑制了蜂蜜中的嗜渗酵母的生长或者活动，有效地控制了嗜渗酵母发酵产生二氧化碳气体和腐败变质的可能性。

3 讨论

本研究用35℃的发酵试验和酵母计数的结果都明确证明了超声波对嗜渗酵母的抑制作用。

超声波本身是一种机械波，超声波作用于被处理物品是受到了强大的机械冲击力，因而物品内部高级结构可能会产生变化。蜂蜜中的微生物内部具有严密的结构性，受到超声波冲击力的影响后，其内部分子的高级结构可能会产生错位、异位或者其他形式的高级机构变化，从而致使微生物失去活性，或者活性降低。因为仅仅的超声波处理，没有进行加热和添加额外物质，所以不会引起蜂蜜品质的改变。这应该是最经济和环保的品质保护措施。

采用超声波技术经过短时间处理即可抑制嗜渗酵母的活动，其工艺并不是特别复杂，除此之外，超声波处理的安全性也是毋容置疑的。

蜂蜜结晶虽然涉及了葡萄糖、果糖、松三糖、蔗糖、糊精和胶体物质等众多物质，但最主要的还是葡萄糖和果糖的比例[8]。按照CAC CODEX STAN 12-1981蜂蜜标准的3.3的要求[5]，不应当采用化学或者生物化学处理来影响蜂蜜的结晶性质，而本试验研究观察到，用于抑菌的短时（小于10 min）超声波处理没有能影响蜂蜜的结晶。作者尝试1 h以上的长时间超声波处理是能够改变蜂蜜结晶的（资料未展示），但是长时间的处理也会使蜂蜜液体温度明显升高，但是即使是超过2 h以上的超声波处理，蜂蜜液体的温度也不可能超过50℃，这个温度界限是快速产生羟甲基糠醛的临界温度。

生产试验用的是百花蜜，其花蜜来源众多且不稳定，造成了葡萄糖和果糖的比例不一致，所以才会出现有包装瓶中的蜂蜜会结晶有的不会结晶。而且就结晶的蜂蜜而言，有结晶多的，也有结晶少的。从生产性试验上进一步说明了，这种短时间的超声波处理不能改变蜂蜜的结晶性质。而加热等处理方式可以破坏形成结晶的晶核，导致最后不会结晶。但是都知道加热之后会导致蜂蜜的酸度、羟甲基糠醛和淀粉酶活性新鲜度三指标明显改变，这是如CAC CODEX STAN 12-1981等国际通性标准所不允许的。

4 结论

本研究采用超声波技术在小于10 min的时间内达到抑制蜂蜜嗜渗酵母的活动，从而阻止蜂蜜发酵产生二氧化碳带来的运输安全问题和蜂蜜腐败风险。

从发酵发泡试验得到5 min之后泡沫的生成量趋于稳定，而酵母计数试验也得到了类似的结果。这不但说明了结果的稳定可靠性，也说明了最佳的超声波处理时间定在5 min到6 min就可以达到抑菌的目的。

本研究仅仅论及了超声波处理蜂蜜后嗜渗酵母的问题，还有大量的问题需要进一步研究，在后续论文中，将进一步揭示蜂蜜经超声波处理后硒含量、蛋白质含量等改变，以及超声波处理蜂蜜后如酸度、羟甲基糠醛和淀粉酶活性等新鲜度品质的改变。从而进一步论证超声波处理给蜂蜜的安全性和内在品质带来的影响。