付昊，龙虎，蔡自建，田诗佳，唐跃珊，丁心舒

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

天然抗氧化剂因在疾病预防与治疗、延缓衰老过程中发挥重要作用而广为人知，在这些天然抗氧化剂中，多糖通常被认为是抗氧化性最强的一种。多糖是由单糖缩合的多聚物，广泛分布在自然界中，是一种重要的活性物质[1]。近年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖与蛋白质、核酸一样，是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一[2]。熟地黄首载于《本草图经》，为玄参科植物地黄的块根。近年研究结果表明，熟地黄多糖（Rehmannia glutinosa polysaccharide，RGP）具有提高机体抗氧化力、免疫力、抗焦虑、降血糖、促进机体细胞有丝分裂、调整肠道免疫系统、抗病毒、抗肿瘤和作为免疫佐剂等作用[3-8]。对于熟地黄多糖的抗氧化作用研究已经取得部分进展，目前国内外对熟地黄多糖的研究主要集中在其有利化学成分的提取技术和药理作用，研究多为水提醇沉法、超声波等提取法从地黄中提取到7种地黄多糖。此外，药理作用已涉及到临床研究应用，包括可作为药物作用理论基础的机体造血、中枢抑制、逆转肿瘤多药耐药等多种功能研究[9-11]，如苗明三等[10]以放血与磷并用致血虚模型大鼠为研究对象探讨熟地黄多糖补血作用；黄霞等[11]用熟地黄多糖灌服小鼠，发现可促进小鼠血清溶血素的生成，提高小鼠巨噬细胞吞噬指数。这些研究说明熟地黄多糖具有提高小鼠免疫功能的作用。但对熟地黄多糖在生物体内长时间作用的动态变化鲜见相关报道。因此，本研究针对熟地黄多糖对小鼠血清和肝脏抗氧化作用的动态变化作进一步探索，为熟地黄多糖在食品中的实际应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

天然熟地黄多糖：陕西森弗天然制品有限公司；昆明种健康小鼠（雌雄各半，120只），体重20 g左右：由四川省中医药科学院提供，许可证号：SCXK（川）2018-19；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒：南京建成生物工程研究所；BCA（bicinchoninic acid）法蛋白定量试剂盒：北京天恩泽生物技术有限公司。

UV-1000型紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；BT25S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 剂量设计

动物饲养于标准环境：温度（23±1）℃，相对湿度（60±5）%，明暗周期12 h，标准颗粒饲料喂养。小鼠于实验环境条件下适应3 d后，随机分为4组，每组30只，分别为实验组（低、中、高剂量组）和对照组。实验组连续每天灌胃给予150、300、550 mg/kg熟地黄多糖，对照组给予等量蒸馏水。小鼠灌胃体积为0.1mL/10 g，灌胃期间自由摄食和饮水。所用实验条件和方法均按照参考文献[12]中抗氧化作用检测方法进行。

1.2.2 小鼠血清和肝脏中SOD、MDA及GSH-Px测定[13-14]

小鼠采血前禁食12h后，所有小鼠称重，灌胃30min后眼眶采血0.5 mL后离心取血清，血样于4 000 r/min离心15 min，分离出血清，-20℃保存备用。随后，小鼠进行颈椎脱臼处死，取其肝脏并称重。在0.9%的预处理冰冷的生理盐水溶液中漂洗，除去残留血液，滤纸拭干。取肝脏组织块500 mg，加入9倍预冷的0.9%生理盐水溶液[料液比为1∶9（g/L）]，在研钵中制成10%的组织匀浆，-20℃保存备用。组织匀浆以3 000 r/min离心15 min，收集上清液。测定指标的所有操作均按试剂盒说明书进行。

1.2.3 数据处理

实验数据采用GraphPad Prism 5统计软件处理。

2 结果与分析

2.1 熟地黄多糖对小鼠体重的影响

在给予小鼠受试物7、14、21、28 d时，分别测定实验组和对照组小鼠的体重，结果详见图1。

图1 服用不同剂量的RGP对小鼠体重的动态影响Fig.1 The effect of different doses RGP on the mice body weight

从图1可以看出，各组小鼠之间的体重没有显著性差异。说明连续服用不同剂量的熟地黄多糖不会对小鼠体重产生影响。

2.2 RGP抗氧化的测定结果

2.2.1 RGP对肝脏和血清中SOD活性的影响

SOD是人体细胞代谢极其重要的一种活性蛋白酶，它能有效催化清除超阴离子自由基的反应。通过检测肝脏和血清中SOD的活性来观察剂量效应，实验结果见图2。

图2 RGP对小鼠肝脏和小鼠血清中SOD活性的影响Fig.2 The effect of RGP on SOD in the liver and serum of mice

如图2所示，低、中、高剂量组的肝脏（图2A）和血清（图2B）中SOD活性均高于对照组（P＜0.05）。连续服用14 d时，中剂量组较显著（P＜0.001）；连续服用21 d时，中剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05），极显著高于高剂量组（P＜0.001）；连续服用28 d时，各剂量组间无明显差异（P＞0.05）。结果表明服用各剂量熟地黄多糖均具有显著增加SOD含量的作用，其中，中剂量影响更显著（P＜0.01）。在同一剂量水平观察时间效应，发现各剂量组SOD活性随时间的增加也呈现出动态增加（P＜0.05）。对于低剂量组SOD含量，21、28 d均极显著高于 14 d（P＜0.001），28 d与 21 d无明显差异（P＞0.05）。各剂量组在连续服用14 d时有增加SOD含量作用，随着时间的延长，SOD含量均呈现先上升后趋于平缓的趋势；对比肝脏和血清，RGP对肝脏中SOD活性增强效果优于血清中。

2.2.2 RGP对肝脏和血清中GSH-Px的影响

GSH-Px是机体内广泛存在的过氧化酶分解酶，可以清除自由基和抑制自由基的反应，减少对生物体的损害，测试GSH-Px含量的变化可体现RGP的抗氧化强度，实验结果见图3。

图3RGP对小鼠肝脏和小鼠血清中GSH-Px的影响Fig.3 The effect of RGP on GSH-Px in the liver and serum of mice

如图3所示，通过剂量效应观察发现低、中、高剂量组肝脏、血清中GSH-Px含量均显著高于对照组（P＜0.05）；中、高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.01，P＜0.05），中、高组间无明显差异（P＞0.05）。表明服用各剂量熟地黄多糖均具有显著增加GSH-Px含量的作用，其中，中、高剂量组的RGP影响更显著（P＜0.01）。对比肝脏和血清，RGP对血清中的GSH-Px的增加能力更明显。在同一剂量水平，通过时间效应观察发现，各剂量组GSH-Px含量随时间增加均明显增加（P＜0.05）。对于低剂量组GSH-Px含量，14 d时与空白组无显著差异（P＞0.05），21 d 明显高于 14 d（P＜0.05），28 d 与21 d无显著差异（P＞0.05）；对于中剂量组GSH-Px含量，14 d时极显著高于空白组（P＜0.001），21 d时明显高于14 d（P＜0.05），28 d时与21d时无显著差异（P＞0.05）；对于高剂量组GSH-Px含量，14 d极显著高于空白组（P＜0.001），21 d 极显著高于 14 d（P＜0.001），28 d极显著高于21 d（P＜0.01）。随着时间的延长，服用低、中剂量的RGP时，GSH-Px先上升后趋于平缓；服用高剂量的RGP时，GSH-Px上升趋势显著高于低、中剂量组。

2.2.3 RGP对肝脏、血清中MDA的影响

MDA在体内自然生成，是氧化应激的标志物，其含量能够判断脂质过氧化的程度，从而反映细胞受损伤的程度，实验结果见图4。

图4RGP对小鼠肝脏和小鼠血清中MDA的影响Fig.4 The effect of RGP on MDA in the liver and serum of mice

如图4所示，通过剂量效应观察发现，低、中、高剂量组肝脏和血清中MDA含量均低于对照组，但在14、21 d时，低剂量组与空白组间无明显差异（P＞0.05），14 d时，中、高剂量组极显著低于空白组（P＜0.001），21 d时，中、高剂量组显著低于空白组（P＜0.01，P＜0.05）；在28 d时，低、中、高剂量组均极显著于空白组（P＜0.01）。中、高剂量RGP均具有显著减少MDA含量的作用，中剂量效果最佳；对比肝脏和血清，RGP对血清中的MDA的降低能力更明显。在同一剂量水平时间效应观察发现，各剂量组MDA含量随时间延长均呈现降低趋势（P＜0.05）。

3 结论

衰老自由基学说是现代衰老理论中具有代表性学说之一，该学说认为自由基的增多是导致机体衰老的重要因素，自由基可使生物膜中的多种不饱和脂类发生超氧化，形成脂质过氧化物，从而引起细胞结构和功能破坏[2]。氧化损伤不仅与多种疾病的发生有着密切的关系，还可诱导机体细胞的坏死与凋亡，是人类衰老的重要原因之一[15-16]。生物体内存在一套完整的抗氧化系统，在正常生理条件下，自由基不断生成，又不断地被清除，从而维持相对的动态平衡[17-18]。因此，选用SOD、GSH-Px活力及MDA含量水平来作为衡量机体抗氧化能力的指标[19-20]。

研究表明，小鼠服用低、中、高剂量的熟地黄多糖，均能够起到提高机体的SOD和GSH-Px活力，并能有效降低MDA含量，表明熟地黄多糖具有抗氧化作用，这与苗明三等的结果一致[4]。熟地黄多糖随着时间和剂量的增加，在一定范围内对机体的抗氧化作用也不断增强，说明熟地黄多糖可通过提高机体内抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化反应以增强抗氧化功能。熟地黄多糖由于添加水平的不同和时间的差异，导致肝脏和血清中的SOD和GSH-Px活性及MDA含量之间的变化趋势略有差异，这可能是由于机体存在不同的抗氧化调节机制引起的，其他研究也表明SOD和GSH-Px在某种状况下并非同时增加，而是一种机制激活时，另一种可能处于抑制状态，在一定范围内呈动态变化，这与黎瑞珍等的研究一致[21]。另一方面，生物氧化反应涉及多种酶，多糖一方面能够抑制脂肪氧化酶，另一方面也可通过抑制与氧化相关的酶而在生物体内发挥抗氧化作用[22-23]。杨兵等[24]研究表明熟地黄多糖对断奶仔猪血清乳酸脱氢酶活性有一定降低作用。而血清乳酸和乳酸脱氢酶是糖代谢中的重要物质之一。由此推测熟地黄多糖可能存在多种抗氧化机理，具体的调节机理还有待进一步研究和探讨。

综上，熟地黄多糖可以提高机体内抗氧化相关酶的活性，抑制自由基的产生和脂质过氧化过程中产生的不良代谢产物，起到较好的抗氧化作用，可在后续研究中分离提取找到活性单体成分，为在食品中的实际开发和利用提供参考。