章小霞，顾丽丽，姜晨霞，王 燕，任晓燕

（1南通市妇幼保健院病理科，江苏226018；2南通大学附属医院病理科）

乳腺癌作为女性中最常诊断的癌症之一,是妇女健康面临的主要威胁[1-2]。全世界每年有超过130万新增患者,约50万人死于乳腺癌[3]。中国近几年乳腺癌的发病率增加近30%,死亡率比过去的30年翻了一番[4]。随着分子生物学的发展,乳腺癌的诊断和治疗取得了一定的进展,但目前的治疗效果及患者的生活质量仍不尽人意[5]。

PFKFB3,即6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶3,在各种生物细胞中广泛存在,其mRNA和蛋白质水平在胃癌、结肠癌、前列腺癌等组织中显著高于正常组织[6-7],但PFKFB3在乳腺癌中的表达及其与患者预后的关系国内尚未有报道。本实验应用免疫组织化学法及定量即时聚合酶链锁反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测PFKFB3在乳腺癌组织中的表达情况,分析PFKFB3表达与临床病理特征及患者预后的关系,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年1月—2012年12月南通大学附属医院病理科130例乳腺癌患者的癌组织及相应癌旁组织（距肿瘤边缘＞5 cm）的石蜡标本。另收集南通大学附属医院2017年6月12例乳腺癌患者手术切除的新鲜癌组织及对应癌旁组织,-80℃冻存待测。所有患者术前均未经任何抗肿瘤治疗,临床资料及随访记录完整,随访截至2017年12月。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测PFKFB3蛋白表达：将收集的130例乳腺癌组织及其癌旁组织石蜡切片,脱蜡,0.3%过氧化氢封闭,PBS冲洗。100℃烤箱烘烤5 min,自然冷却以修复抗原,PBS冲洗3遍。10%小牛血清封闭,PBS冲洗。加入鼠抗人PFKFB3一抗（1∶100）（Abcam公司）,36℃孵育2 h,PBS冲洗3遍。山羊抗鼠IgG二抗（Abcam公司）孵育30 min,PBS冲洗3遍。DAB显色、苏木素复染、封片。

由2名有经验的病理医师采用半定量评分法在显微镜下判读。高倍镜下记录400个细胞,根据染色强度评分：阴性（无黄色）记0分,弱阳性（淡黄色）记1分,中等阳性（棕黄色）记2分,强阳性（棕褐色）记3分。按照染色阳性细胞占所有细胞的百分比记分：无阳性细胞记0分,阳性细胞＜10%记1分,≥10%～＜50%记2分,≥50%～＜80%记3分,≥80%记4分。最终评分=阳性细胞百分比记分×染色强度评分,0～4分为阴性,＞4分为阳性[7]。

1.2.2 qRT-PCR检测PFKFB3mRNA表达：采用Invitrogen公司Trizol试剂盒、qRT-PCR试剂盒。将冻存的12例新鲜乳腺癌新鲜组织用玻璃研磨器进行研磨,提取总RNA,反转录试剂盒进行逆转录合成cDNA,以β-actin为内参,PCR扩增试剂盒进行扩增。特异性引物序列为PFKFB3-F（5′-AGCCCGGATTACAAAGAC TGC-3′） 和 R（5′-GGTAGCTGGCTTCATAGCAAC-3′）。qPCR 反应参数：95 ℃ 3 min、95℃ 50 s、55℃ 40 s、72℃ 60 s,共扩增40循环。实验结果采用2-ΔΔCt表示PFKFB3 mRNA相对表达量,重复3次,取3次平均值。

1.3 统计学处理 使用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量数据以±s表示,两组间比较行t检验,多组比较行方差分析；临床病理特征与PFKFB3表达的关系采用Pearson χ2检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线进行预后分析,采用Log-rank单因素分析及COX比例风险回归模型分析影响预后的因素。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PFKFB3在乳腺癌中的表达免疫组化 结果显示,PFKFB3蛋白主要定位于乳腺癌细胞浆,少量定位于细胞核,阳性表达率为60.8%（79/130）,而癌旁组织为20.0%（26/130）（图1）,差异具有统计学意义（χ2=44.875,P＜0.001）。qRT-PCR 结果显示,乳腺癌组织及癌旁组织PFKFB3 mRNA相对表达量分别为1.73±0.21、0.78±0.21,差异具有统计学意义（P＜0.05）（图 2）。

图1 免疫组化检测PFKFB3蛋白的表达情况（400×）

图2qRT-PCR检测PFKFB3mRNA的表达情况

2.2 PFKFB3蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系 PFKFB3蛋白表达与肿瘤分级、原发肿瘤大小（T）、淋巴结转移（N）、TNM分期及分子分型相关（P均＜0.05）,而与患者年龄、肿瘤部位及组织类型无关（P均＞0.05）。见表 1。

2.3 PFKFB3蛋白表达与乳腺癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存曲线显示,PFKFB3蛋白表达阳性患者的总生存率低于阴性患者,差异有统计学意义（P＜0.001）（图 3）。Log-Rank 检验结果显示,130例患者中位生存时间为61.67±2.67个月,PFKFB3蛋白阴性、阳性者术后5年总生存率分别为80.39%、39.24%,生存时间分别为71.78±1.94个月 、50.07±3.49个月,差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 PFKFB3蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系 例（%）

图3 Kaplan-Meier生存曲线分析PFKFB3表达与乳腺癌预后关系

2.4 影响预后因素分析 单因素生存分析显示,PFKFB3蛋白表达（阴性vs阳性）、肿瘤分级（ⅠvsⅡvsⅢ）、原发肿瘤大小（T1 vs T2 vs T3+T4）、淋巴结转移（N0 vs N1+1+2）、TNM 分期（0+ⅠvsⅡvsⅢ）及分子分型（Luminal A vs Luminal B vs Her2型vs三阴）与乳腺癌患者预后相关（P均＜0.05）,而年龄（＜40岁vs≥40岁,＜60岁 vs≥60岁）、肿瘤部位（左侧 vs右侧）及组织类型（浸润性导管癌vs浸润性小叶癌vs粘液癌vs其他）等与预后无关（P均＞0.05）。多因素分析进一步显示,PFKFB3蛋白表达、TNM分期为乳腺癌患者预后的独立危险因素（P均＜0.05）。见表2。

表2 影响乳腺癌预后因素分析

3 讨 论

近年来乳腺癌的发病率居高不下,发病年龄趋于年轻化[8]。乳腺癌的异质性很高,其临床进展不同,形态学特点各异,分子生物学分型多样,对治疗的反应不一,这些特点严重影响着患者的诊断、治疗及预后。目前乳腺癌根据其分子特点主要分为以下4种亚型：腔面A、腔面B、基底样/三阴型和HER2型[9],依据分子分型对患者进行针对性治疗已取得一定的成效,但是考虑到乳腺癌的复杂性和可变性,新的乳腺癌生物标志物的发现和治疗靶点的鉴定显得更为重要[10]。

恶性肿瘤的增殖、侵袭及远处转移均需要足够的营养和能量,肿瘤细胞代谢旺盛,为了满足快速增殖及侵袭转移的需要,必须精细调节自身的能量代谢,即所谓的代谢重编程,其中最为主要的代谢方式是“有氧糖酵解”。肿瘤细胞在有氧情况下仍能维持高水平的无氧糖酵解,可将葡萄糖分解成乳酸,即Warburg效应[11],因此抑制肿瘤细胞的糖酵解即可抑制其增殖分化及远处转移。PFKFB家族有4个亚型：PFKFB1、2、3、4,它们在组织中的表达及作用不同。1995年从脑组织中发现并分离出PFKFB3[12],具有激酶和磷酸酶的双重活性,其激酶活性较强,磷酸酶活性较弱[13]。

因PFKFB3C端序列的不同,分为光谱型和诱导型,后者在正常组织中的表达水平非常低,在许多肿瘤细胞中表达水平较高,如胃癌,结肠癌、肺癌及前列腺癌等[14]。作用机制如下：PFKFB3是磷酸果糖激酶-1（PFK-1）激活剂,PFKFB3的升高可增强PFK-1的活性,促进肿瘤细胞摄取的葡萄糖迅速酵解,为细胞增殖提供足够的能量；其次,PFKFB3对于含有Ras转化细胞肿瘤的生长十分必要,促进正常的血管生成以及肿瘤细胞的生长,加速肿瘤的发生与发展；再次,HIF-1α和p38／MK2信号通路的激活及PFKFB3第461位点丝氨酸的磷酸化可使其表达上调,进而促进肿瘤细胞的增殖[15]；另外,PFKFB3在细胞周期和细胞凋亡中也发挥一定的作用[16]。由此可见,PFKFB3在维持癌症的发展和进展中发挥着重要作用,可能成为癌症治疗一个有吸引力的靶点[17]。

本研究对130例乳腺癌标本研究结果显示,PFKFB3蛋白在乳腺癌组织中表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义（P＜0.001）；PFKFB3蛋白表达与肿瘤分级、原发肿瘤大小（T）、淋巴结转移（N）、TNM分期及分子分型相关（P＜0.05）；5年生存率PFKFB3蛋白阴性患者为80.39%,阳性患者为39.24%,差异有统计学意义（P＜0.05）；多因素分析表明PFKFB3蛋白表达、TNM分期是乳腺癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）,提示PFKFB3与肿瘤细胞增殖、分化及侵袭能力密切相关,可促进乳腺癌的发生、发展,是乳腺癌患者预后的危险因素。

综上所述,PFKFB3在乳腺癌组织中高表达,且与肿瘤的侵袭和转移密切相关,其高表达提示乳腺癌患者预后不良。