褚杨芳，圣 钰，刘益飞，周国雄

（1南通瑞慈医院消化内科，江苏226010；南通大学附属医院2病理科，3消化内科）

我国溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）的发病率逐年上升[1-2]。该病病程漫长,常反复发作,病因及发病机制尚未明确,被世界卫生组织列为现代难治病之一。UC病变主要限于结肠粘膜和粘膜下层,呈连续性弥漫性分布,以肠道细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解和粘膜溃疡形成为主要的病理特点。ECM主要成分有蛋白聚糖、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白（laminin,LN）、纤维连接蛋白等。目前认为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）在ECM降解中起重要作用[3],但具体机理尚未明确。LN是ECM主要成分之一,不同LN三聚体有不同的功能,能调节细胞两极、附着、播散以及迁移。Spenle等[4]研究发现UC患者结肠组织基底膜的LN免疫反应缺失。

MMPs属于胶原酶类家族,目前已发现有28种MMPs[5],其基质底物包括明胶、胶原、蛋白多糖以及非基质底物MMP-9、MMP-3前体。MMP-13结构区域包括信号肽、前驱肽区、催化区及类血红素结合蛋白区。MMP-13在MMPs激活过程中发挥重要的作用,可激活其他亚型MMPs,也可被其他MMPs激活。MMP-13在多种生理和病理过程中表达增高,例如在药物诱导的小鼠结肠炎相关肠道肿瘤中表达明显上调[6],在吸烟者口腔鳞癌中的表达也增加,且与TNM分期及淋巴转移有关[7],在骨关节炎模型中表达增加[8]。国外 Vizoso[9]、Rath[10]等发现炎性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）患者中MMP-13表达增加。

本研究选取南通瑞慈医院和南通大学附属医院2015年1月—2017年5月UC患者30例肠镜下病变部位活检标本以及病变远端10例正常粘膜标本,联合检测LN和MMP-13的表达,分析二者与病变程度的关系,以期探讨UC的发生发展机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 慢性复发型UC患者30例均符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年）》诊断标准,其中男性8例,女性22例,平均年龄49.73±16.50岁,根据Mayo指数分度：轻度7例,中度11例,重度12例。均行电子结肠镜检查,取病变部位活检标本30例,取病变远端正常粘膜标本10例。本研究获得两家医院伦理委员会批准同意。

1.2 方法 将石蜡包埋的结肠组织切片,厚度5μm。HE常规染色。免疫组化染色：切片经二甲苯脱蜡至水,梯度酒精脱苯。0.01 mol/L PBS冲洗3次,浸于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中,100℃,10 min,重复2次,室温冷却,放入自动免疫组化染色仪。滴加3%H2O2,室温孵育10 min,0.01 mol/L PBS冲洗3次,滴加一抗LN或MMP-13室温过夜。0.01 mol/L PBS冲洗3次,滴加羊抗兔二抗,37℃孵育60 min,0.01 mol/L PBS冲洗3次。滴加高敏过氧化物酶复合物工作液,37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS冲洗3次。0.05%DAB显色至阳性部位出现特异性显色,脱水、透明、封片,光镜下观察。严格按使用说明书配制LN抗体、MMP-13抗体（艾博康上海公司）浓度。

1.3 免疫组化结果判定 显微镜高倍镜下细胞质和细胞核内出现棕黄色颗粒或团块为阳性细胞,根据阳性细胞所占比例分5级[11]：0=阴性（-）,1=阳性细胞占细胞总数的1%～25%（+）,2=阳性细胞数占细胞总数26%～50%（++）,3=阳性细胞占细胞总数的51%～75%为（+++）,4=阳性细胞占细胞总数75%～100%（++++）。

1.4 统计学处理 通过EXCEL表导入数据,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理分析。定性数据差异性比较采用χ2检验,强度及相关分析采用Spearman等级相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

图1 UC病变远端粘膜HE染色（400×）

图2 UC病变粘膜HE染色（箭头所指为隐窝脓肿，400×）

2.1 HE染色 UC病变远端粘膜腺体结构完整,排列整齐,杯状细胞较多（图1）；UC粘膜病变区腺体数目减少,杯状细胞减少,见大量淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润,隐窝可见小脓肿（图2）。2.2 LN表达 UC病变肠粘膜30例中20例LN表达阳性（66.7%）,10例病变远端粘膜LN表达均阳性（100.0%）,UC病变组与对照组LN表达差异有统计学意义（χ2=4.444,P＜0.05）。重度UC组LN表达阳性率低于正常对照组,差异有统计学意义（χ2=10.476,P＜0.05）,轻度、中度UC表达阳性率与正常对照组比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析显示,三组病变程度与LN表达强度呈负相关（r=-8.222,P＜0.001）,提示随着UC病情程度的加重,LN表达逐渐减少,重度UC病变组LN表达最低。见表 1,图 3、4。

表1 UC肠粘膜LN表达 例

图3 对照组LN表达（400×）

图4 重度UC组LN表达（400×）

2.3 MMP-13表达 30例UC病变肠粘膜中25例MMP-13表达阳性（83.3%）,10例病变远端粘膜1例MMP-13表达阳性（10.0%）,UC病变组与对照组MMP-13表达差异有统计学意义（χ2=17.729,P＜0.001）。中度 UC 组（χ2=13.747,P＜0.001）、重度 UC组（χ2=18.277,P＜0.001）MMP-13表达阳性率与正常对照组比较,差异均有统计学意义。随着病变程度的加重,MMP-13表达率逐渐增加,轻度UC组表达率与重度组比较,差异有统计学意义（χ2=8.686,P＜0.05）。相关性分析显示,病变程度与MMP-13表达强度呈正相关（r=0.834,P＜0.001）,提示随着UC病情程度的加重,MMP-13表达逐渐增强。见表2,图5、6。

表2 UC肠粘膜MMP-13表达 例

图5 轻度UC组MMP-13表达（400×）

图6 重度UC组MMP-13表达（400×）

2.4 LN与MMP-13表达的相关性 UC病变肠粘膜及远端正常粘膜LN与MMP-13表达的相关性分析显示,两者呈负相关（r=-0.913,P＜0.001）,随着 LN表达的减少,MMP-13表达逐渐增加。见表3。

表3 LN与MMP-13表达的相关性

3 讨 论

LN是细胞外基质（ECM）中的非胶原糖蛋白,广泛存在于基底膜的透明层,对维持基底膜结构与功能的完整性起了极其重要的作用。当LN遭到破坏时,肠粘膜表现为基底膜破坏,细胞间隙增大,通透性增加,肠屏障受损,细菌与毒素移位,从而引发失控的炎症反应。本研究发现,UC病变远端肠粘膜腺体结构规则,隐窝大小相似,见较多杯状细胞和较少的中性粒细胞,LN位于被覆上皮细胞及腺体基底膜部,呈连续状（见图3）。UC病变组织随着病情进展,腺体逐渐减少,淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞逐渐增多,隐窝可见小脓肿,杯状细胞逐渐减少,LN表达出现不同程度的缺损、变薄及中断,重度UC者呈碎片状（见图4）。UC病变粘膜LN表达明显少于远端正常肠粘膜,差异有统计学意义（P＜0.05）,与Spenlé等[4]研究结果相符。UC病变程度与LN表达强度呈负相关（P＜0.001）,提示随着UC病情的加重,LN表达逐渐减少。

MMP-13能降解大部分ECM,目前已发现有28种MMPs[12],其中MMP-13属于胶原酶,主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和结缔组织胶原的三螺旋结构[13]。本研究发现,UC病变远端正常肠粘膜中MMP-13表达极少,表达率仅为10.0%,而病变部位MMP-13总表达率83.33%,中、重度UC病变组织MMP-13表达明显高于病变远端正常肠粘膜,差异均有统计学意义（P＜0.05）,与 Vizoso等[9]研究结果相符。在病变区域内MMP-13广泛分布于淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞胞浆内,随着UC病情的加重,MMP-13表达逐渐增加（图5、6）,相关性分析显示UC病变程度与MMP-13表达强度呈正相关（P＜0.001）,说明随着UC病情的加重,MMP-13表达逐渐增强。此外,LN表达与 MMP-13表达呈负相关（P＜0.001）,随着LN表达的减少,MMP-13表达逐渐增加。

LN是ECM主要组成成分,在重度UC中LN表达明显减少,提示ECM遭到破坏,临床上可能提示粘膜溃疡形成,是否可通过某种途径增加LN的表达,来改善粘膜破损。MMP-13能降解ECM,且其表达与LN呈负相关,MMP-13是否通过某种途径参与基底膜损伤的发生发展,能否通过药物干预减少MMP-13的表达,从而缓解基底膜损伤或使肠粘膜修复。这些疑问可能为将来UC的治疗研究提供新的方向。