赵蔚波，王 琦，郑燕飞，姚海强，王 济

（北京中医药大学，北京100029）

体质是在先天遗传和后天获得的基础上，表现出的形态结构、生理机能以及心理状态等方面综合的、相对稳定的特质，这种特质决定着人体对某种致病因子的易感性及其病变类型的倾向性。国医大师王琦教授根据中国人的体质特点，以中医理论为基础，将人的体质分为平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质（过敏质）[1]。随着现代分子生物学的发展，不断有新的方法和技术涌现。包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学的系统生物学研究技术已被逐渐应用于中医体质的研究领域，并已取得了一定的研究成果[2-3]。如何利用单细胞测序技术对中医体质展开研究，笔者试作探讨。

1 单细胞测序技术及其在医药领域的应用

1.1 单细胞测序技术概况 单细胞测序技术是指对单细胞基因组或转录体进行测序，以获得基因组、转录组或其他多组学信息，以揭示细胞群体差异和细胞进化关系。传统的测序方法只能得到多个细胞的平均值，不能分析少数细胞，丢失细胞异质性信息。与传统的测序技术相比，单细胞技术具有检测单个细胞间异质性的优点[4]。人体由不同类型和起源的万亿个细胞组成，每个细胞在人体系统中都发挥着各自的作用。这些细胞可以被视为支持不同身体状态的基本但必不可少的生物单位，例如健康、疾病或对治疗的反应[5]。每个细胞都是独一无二的，即使是相同细胞系或个体来源的细胞，彼此的基因组、转录组和表观基因组都会有所差异[6]。单细胞测序技术旨在单个细胞水平对基因组或转录组进行扩增并测序，检测单核苷酸变异（NVs）、基因拷贝数变异（NVs）、单细胞基因组结构变异、基因表达水平、基因融合、单细胞转录组的选择性剪接、单细胞表观基因组的DNA甲基化状态等[7]。

1.2 单细胞测序技术在医药领域的应用 单细胞测序技术已在癌症、微生物学、神经学、生殖、免疫学、消化系统中得到应用，并取得成果。其中在癌症领域具有重要地位，已有研究绘制了肝癌微环境免疫图谱和肺癌T细胞免疫图谱，揭示了肝癌和肺癌免疫细胞的亚组分类、组织分布特征、肿瘤异质性和药物靶基因表达情况，有助于了解肝癌和肺癌的免疫微环境，寻找有效的生物标志物、新的肿瘤免疫治疗方法和药物靶点[8-9]。使用单细胞mRNA测序（scRNAseq）在最早阶段了解乳腺癌的起源，并可能最终形成预防癌症进展的基础[10]。

单细胞测序在血液病的研究，有助于发现高异质性血液病的分类标志，分析其发病原因，为临床诊断和治疗疾病提供理论依据。进一步确定了与原发性血小板增多症（ET）相关的候选突变，并推测这些突变可能与肿瘤进展有关[11]。通过靶向单细胞测序证明T细胞急性淋巴细胞白血病（T-All）的突变序列，T-ALL的发育可以在多能祖细胞中开始[12]。在神经学研究中，应用单细胞测序技术鉴定了人类中期胚胎多个区域细胞的多个亚群体，并分析了这些区域的基因表达和神经元成熟[13]。通过单细胞测序绘制的小鼠小脑发育图中，确定了一个小脑细胞子集和一个有利于小脑发育的亚群体，将有助于今后对小脑发育、神经生物学和疾病的研究[14]。

在生殖医学应用中，单细胞测序技术可以检测出少数细胞的优势，可用于产前诊断和辅助生殖[15-16]。应用单细胞测序技术对妊娠早期胎盘细胞进行转录组分析，有助于胎盘和生殖成功[17]。在免疫学领域，用单细胞RNA测序法研究持续感染期间的免疫细胞和细胞因子。研究发现不同感染时IL-10表达CD4 T细胞的异质性和辅助性细胞产生IL-10在促进体液免疫中起着重要作用[18]。在消化系统的应用中，发现许多新的肠上皮细胞亚型，并解释了肠道细胞维持稳态和对病原微生物反应的机制[19]。应用高精度单细胞转录组序列分析人胚胎期的四个消化器官和成人大肠的多个细胞，揭示基因调控在人类四个消化器官发育过程中的相关机制[20]。但未能查阅到单细胞测序技术与中医结合进行的研究。

2 单细胞测序技术在中医体质学研究中应用的思考

国医大师王琦教授对中医体质学进行系统阐述，首先提出中医体质学的四个基本原理，概括为禀赋遗传论、形神构成论、生命过程论、环境制约论，构筑了中医体质理论体系的基石。后又相继指出：体质可分论、体质可调论、体病相关论，作为体质研究的三个关键科学问题，成为进行体质研究的总体框架[21]。单细胞测序可应用在对中医体质的“基本原理”或“关键问题”等方面的阐释，对此试作以下探讨。

2.1 应用于中医体质学“禀赋遗传论” 中医体质学“禀赋遗传论”认为禀赋遗传是决定体质形成和发展的主要内在因素。体质差异、个体体质的形成在很大程度上是由遗传所决定的，不同个体的体质特征分别具有各自不同的遗传背景，这种由遗传背景所决定的体质差异，是维持个体体质特征相对稳定性的一个重要因素。从基因水平及其表达产物水平揭示体质差异的遗传学机制，已成为中医体质学的研究方向之一。由于体质是一个整体的性状，故难以用一个基因或一个蛋白质来诠释其差异性，现在多采用组学的方法进行研究。已有研究用单细胞测序法检测卵细胞极性细胞或胚胎细胞，选择健康胚胎移植，可以降低先天性遗传病新生儿的出生率，有助于预防遗传病[15-16]。

2.2 应用于中医体质学“生命过程论” 中医体质学“生命过程论”认为体质是一种按时相展开的，与机体发育同步的生命过程。体质的发展过程表现为若干阶段，幼年稚阴稚阳→青年气血渐盛→壮年气血充盛→老年五脏气衰。其中每个阶段的体质特性也有相应的差异，这些不同的体质阶段依机体发育的程序相互连接，共同构成个体体质发展的全过程。不同个体的体质发展过程，由于先天禀赋的不同而表现出个体间的差异性。用单细胞测序研究小鼠个体小胶质细胞在发育期间、老年时和脑损伤后的RNA表达模式，在年轻小鼠中发现了最大的小胶质细胞异质性；然而，一些状态-包括富含趋化因子的炎性小胶质细胞-在整个生命周期中持续存在或在老年小鼠脑中持续存在[22]。对不同状态的小鼠CD4+T细胞进行单细胞RNA测序，发现衰老影响细胞转录动力学，有助于解释随着年龄的增长免疫系统的削弱[23]。

2.3 应用于中医体质学“形神构成论” 中医体质学“形神构成论”认为体质是特定躯体素质与相关心理素质的综合体，构成体质的躯体素质和心理素质之间的联系是稳定性与变异性的统一，体质分型或人群个体差异性的研究应当注意到躯体-心理的相关性。用单细胞测序研究神经元细胞，研究长散在核元件与神经元的关系。发现在神经元干细胞向干细胞分化的过程中，长散在核元件会通过反转录转座在基因组内发生跳跃形成新的插入，而且每个神经元可能含有独特的长散在核元件插入，每个神经元可能不同于其他的神经元，这些差异可能影响个体对神经疾病的易感性[24]。

2.4 应用于“体质可分”研究 中医体质学“体质可分论”认为，体质的形成与先后天多种因素相关。在生命的不同阶段个体的体质特征进行着动态的变化，所以体质表现出个体差异性，呈现动态多样性[25]。中医体质学认为体质的形成是遗传和环境共同作用的结果，通过单细胞测序技分析不同细胞类型中微量的个体细胞表达情况，可以鉴别出许多差异表达基因，发现不同的表达模式和特异性标记[4]。运用单细胞测序技术对不同体质类型的人群外周血中单个核细胞进行检测和分析，可以对体质差异中所伴随差异表达基因进行了解和认识，就有可能发现相关体质类型的基因标志物簇，从而找到体质可分的生物学依据，进而为单细胞测序方法进行中医体质关键科学问题的研究奠定基础。

2.5 应用于“体病相关”研究 中医体质学“体病相关论”认为，由于受先天因素或后天因素的影响，个体体质的差异性对某些致病因素有着易感性，或对某些疾病有着易罹性、倾向性，形成某类疾病发生的背景或基础[25]。以单细胞测序技术检测受试者外周血细胞群特征，发现每种体质类型特点，比较不同体质类型差异。已有研究通过单细胞转录体序列分析证实了候选致病基因在先天性肾病中的表达特点，为治疗先天性肾病作出了一定的贡献[26]。因此对人体体质进行的单细胞测序技术检测应用于人体疾病的预测具有可行性，可望实现重大疾病早期预测、早期预警，为疾病防治提供研究基础和临床依据。

2.6 应用于“体质可调”研究 中医体质学“体质可调论”认为体质既禀成于先天，亦关系于后天。体质的稳定性由相似的遗传背景形成，年龄、性别等因素也可使体质表现出一定的稳定性。然而，体质的稳定性是相对的，每一个体在生长壮老的生命过程中，因受环境、精神、营养、锻炼、疾病等内外环境中诸多因素的影响，而使体质发生变化，从而使得体质具有相对的稳定性同时具有动态可变性，这种特征是体质可调的理论基础[25]。多发性骨髓瘤（MM）是一种骨髓（BM）衍生的浆细胞癌，从多发性骨髓瘤病人中分离出肿瘤细胞进行单细胞分析，利用单细胞测序（DNA测序）技术监测基因突变和对该病的治疗效果，且该研究表明MM CTC分析可能取代骨髓（BM）活检[27]。因此利用单细胞测序技术预测和监控治疗效果和预后情况可行。

3 展望

中医体质学强调人体体质的整体性和系统性。中医体质研究应以中医理论为指导，将宏观与微观研究相结合，单靠一个技术或学科的运用难以获得有效突破。借用单细胞测序技术和现代实验方法，更加深入地探求人体体质形成的机理和规律，探索人体体质与疾病关系的潜在生物学机制，为中医体质学研究领域提供更加广泛的客观依据。随着测序成本的降低，通过提供更准确的信息，单细胞扩增方法将在未来获得更多的优势。单细胞测序技术的研究和检测会更加细致深入，应用领域也会越来越广，在单个细胞水平探讨生命过程将以全新的视角探究生命活动规律，造福人类健康。