蔡梦洁， 钱嘉莉， 陈逸菲， 王岩金， 赵婷， 刘锦文， 沈松， 严永敏

(江苏大学1. 医学院， 2. 药学院，江苏 镇江 212013)

我国慢性肝病患者约2 000万，其中25%～40%最终发展为肝硬化甚至肝癌[1-2]。防治和逆转肝纤维化是延缓或阻止肝硬化和肝癌发生的重要手段，迄今，尚无治疗肝纤维化的理想药物。肝纤维化的主要发生机制是肝内肌成纤维细胞大量合成细胞外基质，导致细胞外基质合成与降解失衡。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化是肌成纤维细胞的主要来源，并伴随着miRNAs的变化[3-4]。调节miRNAs的表达可抑制HSC的活化，阻断甚至逆转肝纤维化。

外泌体(exosome)是一种直径30～100 nm，由细胞内多胞体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的非可溶性膜性囊泡。外泌体携带其来源细胞的遗传信息(蛋白或mRNA、miRNA)，通过受体结合、胞吞、胞膜融合等方式进入靶细胞，在组织损伤修复、免疫调节等方面发挥着重要作用。我们的前期研究发现，脐带间充质干细胞分泌的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosome, HucMSC-ex)能够抑制HSC的活化和肝组织纤维化[5]，但其具体机制尚不明确。研究表明，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路与HSC活化及肝纤维化的发生发展密切相关[6]，TGF-β1受体1(TGF-βR1)启动子区域含有miRNA分子Let-7b的结合位点[7]。由此推测，HuMSC-ex可能通过转运Let-7b下调HSC中TGF-βR1表达，从而抑制HSC活化和胶原合成。本研究拟采用TGF-β1诱导的HSC活化细胞模型，观察HucMSC-ex对HSC胶原合成的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

LX-2细胞株(上海信裕生物科技有限公司)；H-DMEM、α-DMEM、FBS、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；ExoQuick 外泌体试剂盒(美国SBI公司)；蛋白酶抑制剂(德国CST公司)；兔抗人β-肌动蛋白多克隆抗体、兔抗人CD9多克隆抗体、小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(美国bioworld)；小鼠抗人CD63单克隆抗体(德国Millipore公司)；小鼠抗人TGF-βR1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记羊抗兔/鼠二抗(CWBIO公司)；反转录试剂盒、SYBR Green PCR 试剂盒(德国QIAGEN公司)；Let-7b模拟物(吉玛基因有限公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美国Invitrogen公司)；100Kda MW CO超滤离心管(MBI公司)；荧光定量PCR仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；ImageQuant LAS4000mini化学发光成像仪(日本GE公司)；倒置式生物显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 HucMSC-ex分离提取

根据本实验室已建立的方法[5]分离HucMSC，采用含10% FBS的α-DMEM，37 ℃、5%CO2培养，所有脐带来源于2016年10月镇江市第四人民医院知情同意的健康孕妇。根据外泌体提取试剂盒说明，收集HucMSC培养上清液，超滤离心管4 ℃以1 000×g离心30 min，收集浓缩液；0.22 mm滤器过滤除菌后，加入沉淀液(浓缩液 ∶沉淀液=5 ∶1)，充分混匀后，4 ℃孵育过夜(>12 h)；次日，4 ℃以1 500×g离心30 min，弃上清液，PBS重悬沉淀获得HucMSC-ex，分装冻存于-80 ℃备用。

1.3 LX-2细胞株培养、分组及Let-7b转染

LX-2细胞株采用含10% FBS的H-DMEM，于37 ℃、 5% CO2培养。取对数生长期的LX-2细胞株以1.25×105/mL密度接种于6孔板，分别加入浓度为25、50、100 μg/mL HucMSC-ex，另设对照组，常规培养，作用48 h后收集细胞，进行蛋白质和RNA分析。

另取处于对数生长期的LX-2细胞株，接种于6孔板，分别转染随机miRNA序列(对照组)和转染50、100 nmol/mL Let-7b模拟物(模拟物组)。采用Lipofectamine 2000按操作说明进行细胞转染，转染6 h后更换含有10% FBS的完全培养基；48 h后收集细胞进行蛋白质和RNA分析。

1.4 qRT-PCR检测Col1、Col3、TGF-βR1和Let-7b等mRNA表达

按Trizol试剂操作说明提取LX-2细胞株总RNA，核酸蛋白检测仪测定浓度，取D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0之间的RNA样品，琼脂糖凝胶电泳鉴定质量好的RNA标本进行反转录，按试剂盒说明书操作合成cDNA。PCR反应体系为2×SYBR Green Super混合物10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL和0.1% DEPC水8 μL。PCR循环参数如下，Col1、Col3、TGF-βR1及β-肌动蛋白mRNA检测：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s并采集荧光信号，35个循环；Let7b mRNA检测：95 ℃预变性15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s (Let7b及U6)，63 ℃ 30 s并采集荧光信号，40个循环。每个样本重复测定3 次。使用StepOneTM软件进行熔解曲线分析，Col1、Col3、TGF-βR1检测以β-肌动蛋白为内参基因，Let-7b检测以U6为内参基因，采用相对定量 2-△△Ct法分析结果。

1.5 蛋白质印迹法检测CD9、CD63、TGF-βR1和α-SMA的表达

根据细胞数目大小，加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，超声法常规裂解细胞，于4 ℃以15 000×g离心15 min，去除沉淀，获得细胞蛋白样品；HucMSC-ex等体积加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，涡旋振荡1 min，冰上静置10 min，重复振荡和静置3次，获得HucMSC-ex蛋白样品。根据BCA试剂盒说明，绘制标准曲线并检测细胞及HucMSC-ex蛋白浓度。样品中加入蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10 min。10% SDS-PAGE分离蛋白，电转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；孵育兔抗人一抗CD9(1 ∶500)、小鼠抗人CD63(1 ∶500)、小鼠抗人TGF-βR1(1 ∶1 000)、小鼠抗人α-SMA(1 ∶1 000)、兔抗人β-肌动蛋白(1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜；PBST洗涤3次，每次5 min；HRP标记羊抗兔/羊抗鼠二抗(1 ∶3 000)室温孵育1 h；PBST洗涤3次，每次5 min；洗涤后采用化学发光成像仪进行成像分析。

1.6 Let-7b的靶基因预测

采用TargetScanHuman软件(Release 7.2版本: 2018年3月)，根据软件操作说明在线预测Let-7b的靶基因。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 HucMSC-ex的鉴定

透射电镜观察结果显示，提取的HucMSC-ex为球形膜性小囊泡，胞膜结构完整，直径为30～100 nm。蛋白质印迹法结果显示，HucMSC-ex表达外泌体标志分子CD9、CD63。见图1。

A：透射电镜观察HucMSC-ex的形态；B：蛋白质印迹检测结果，1和2分别为提取的2批HucMSC-ex

图1HucMSC-ex的鉴定

2.2 HucMSC-ex抑制HSC胶原合成

qRT-PCR检测结果显示，4组LX-2细胞中Col1、Col3 mRNA表达水平差异有统计学意义(P均<0.001)；与对照组相比，25、50、100 μg组Col1、Col3 mRNA表达均明显降低(P均<0.01)。由此表明，HucMSC-ex可显著抑制LX-2细胞胶原蛋白合成。见图2。

a：P<0.01

2.3 HucMSC-ex抑制LX-2细胞TGF-βR1表达

与对照组相比，25、50、100 μg处理组TGF-βR1mRNA表达均明显降低(P均<0.01)。蛋白质印迹法检测也证实，HucMSC-ex处理后，细胞中TGF-βR1表达明显降低(P<0.01)，其中100 μg组TGF-βR1表达降低最显著。由此表明，HucMSC-ex可下调TGF-βR1的表达。见图3。

2.4 HucMSC-ex通过Let-7b调控TGF-βR1表达

由图4可见，25、50、100 μg HucMSC-ex处理组中Let-7b表达均显著高于对照组，而TGF-βRimRNA表达显著低于对照组(P<0.01)，其中50 μg组作用最显著，提示HucMSC-ex呈剂量依赖性地促进Let-7b表达。由图5可见，与对照组相比，LX-2 过表达Let-7b后TGF-βR1和α-SMA表达显著下调(P均<0.05)，且Let-7b浓度越高，对TGF-βR1和α-SMA的下调作用越明显。上述结果初步证实，HucMSC-ex可能通过转运Let-7b调控TGF-βR1，抑制肝星状细胞活化。

a：P<0.01

a：P<0.01； b:P<0.05

a：P<0.01

3 讨论

肝纤维化是机体对各种病理因素造成组织损伤的一种修复反应，是肝硬化和肝癌的前期必经过程。肝星状细胞的活化、MMPs/TIMPs失衡和TGF-β信号通路是肝纤维化发生发展中的3个关键因素。HucMSC-ex因取材便捷、低免疫原性和无道德伦理约束等优点而应用广泛。本研究结果显示，HucMSC-ex能够体外抑制HSC活化，降低LX-2细胞中Col1和Col3的表达，与前期研究结果一致[3]。

研究发现，胎盘绒毛膜MSC来源的外泌体能够转运miR-125，通过调控Hedgehog信号通路抑制HSC活化[8]。脂肪MSC来源的外泌体能够转运miR-122抑制HSC的增殖及活化[9]。TGF-β1是促HSC活化及肝纤维化的关键细胞因子[10]。本研究通过qRT-PCR检测发现，HucMSC-ex携载Let-7b分子，HucMSC-ex作用后LX-2细胞中Let-7b表达水平增加，TGF-βR1表达降低。为进一步证实Let-7b对TGF-βR1的调控作用，本实验采用Let-7b模拟物分析两者之间的关系，结果表明Let-7b能够显著抑制TGF-βR1表达。由此表明，HucMSC-ex可能通过转移Let-7b抑制TGF-βR1表达，下调TGF-β信号通路，抑制HSC活化和胶原沉积，提示Let-7b可能成为肝纤维化治疗的一个潜在靶点。

本研究证实HucMSC-ex对LX-2细胞活化及TGF-βR1表达具有抑制作用，其机制可能与调控LX-2细胞Let-7b表达有关。然而，HucMSC-ex在肝纤维化模型中是否能够转运Let-7b定位于HSC，调控TGF-βR1表达，抑制HSC活化及其胶原的合成仍需要进一步观察；HucMSC-ex对TGF-βR1信号通路下游分子的作用仍需进一步证实；HucMSC-ex作为遗传信息的载体，含有大量的mRNA、miRNA及蛋白，除了Let-7b外其他的功能分子也可能在HSC活化中发挥作用，有待后续进一步寻找。