陈吉祥， 陈金才， 党胜春， 崔磊， 钱小宝

(江苏大学附属医院胃肠外科， 江苏 镇江 212001)

根据最新流行病学统计数据显示，胰腺癌死亡率在全球常见肿瘤中排第4位[1]。因诊断困难，难以早期发现，且恶性程度高，胰腺癌预后较差，患者5年生存率小于5%[2]。胰腺癌治疗的关键在于早期诊断，但因为胰腺系腹膜后器官，早期病灶难以发现。目前一些临床常用的肿瘤标志物虽然对胰腺癌的诊断、治疗效果监测及预后评估起到了一定作用，但特异性和敏感性较低[3]。

叉头框(forkhead box，FOX)家族是具有一段高度保守的DNA结构域的转录因子超家族，包含至少43个成员[4-7]，叉头框C2(forkhead box C2，FOXC2)转录因子是人类forkhead家族的一个重要成员，与血管淋巴管的形成、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗[8-10]以及2型糖尿病[11]等密切相关。另外，FOXC2在乳腺癌[12]、妇科恶性肿瘤[13-14]、食管癌[15]、胃癌[16]等多种恶性肿瘤细胞中呈过表达。进一步研究发现，FOXC2能够使癌细胞获得侵袭和转移的能力，其与肿瘤的上皮-间质转化密切相关[17]。然而，FOXC2在胰腺癌组织中的表达及其对各临床指标的影响尚不清楚。本研究旨在通过检测胰腺癌组织中FOXC2的表达，分析其与胰腺癌患者临床资料的相关性，了解FOXC2对患者生存时间的影响。

1 材料与方法

1.1 胰腺癌公共数据资料

利用Oncomine数据平台，根据研究目的设定筛选条件：(1) Cancer Type：pancreatic cancer；(2) Gene：FOXC2；(3) Data Type：mRNA；(4) Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5) Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 主要试剂和材料

FOXC2小鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗小鼠IgG二抗(上海倍卓生物科技有限公司)；山羊血清(郑州九龙生物制品公司)；反转录试剂盒(上海Fermentas公司)；SYBR Green PCR试剂盒(美国Thermo公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)。

高速低温冷冻离心机，酶标仪(美国Thermo公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；Real-time PCR扩增仪(美国ABI公司)。

1.3 患者信息及标本采集

收集2005年1月至2009年12月于江苏大学附属医院普外科行胰腺癌根治术的112例胰腺癌患者癌组织及相应癌旁组织。纳入标准：术前影像学检查未见远处转移；术后病理学确诊为胰腺导管腺癌；年龄30～85岁；术前均未接受放化疗。其中，男63例，女49例，年龄35～81岁。癌旁组织取距离肿瘤边缘2 cm以上[18]。以美国癌症联合委员会第八版胰腺癌分期系统作为临床分期分级标准。本研究经江苏大学附属医院伦理委员会批准，患者均知情同意。所有患者随访至2013年12月。

1.4 实时定量PCR法检测FOXC2 mRNA的表达

使用Primer 5.0设计引物序列。FOXC2：上游引物，5′-AGCTACATCGCGCTCATCAC-3′；下游引物，5′-CGTTCTCGAACATGTTGTAG-3′；GAPDH(内参)：上游引物，5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′；下游引物，5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。使用Trizol法从癌组织和匹配的癌旁组织中提取总RNA，将纯化后的总RNA溶于40 μL DEPC水中。用反转录试剂盒合成cDNA文库，反应体系25 μL，其中RNA引物12 μL，5×反转录反应缓冲液5 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，25 U/μL RNA酶抑制剂1 μL，200 U/μL M-MLV反转录酶1 μL，Oligo(dt)18 μL，去离子水(不含RNA酶) 4 μL；反应程序：37 ℃ 60 min；85 ℃ 4 min；4 ℃ 5 min。PCR反应体系25 μL，其中SYBRTM荧光预混液12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，去离子水9.5 μL，cDNA模板2 μL(对照加入等量的去离子水)；反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。采用ABI Prism 7300 SDS 软件分析数据，用公式2-△△Ct计算mRNA相对表达量。每组实验重复3次。

1.5 免疫组织化学染色检测FOXC2蛋白的表达

取临床胰腺癌组织和配对癌旁组织蜡块标本进行连续切片，厚度为5 μm，吸附于防脱载玻片上。将切片置于温箱中60 ℃烘烤1 h，二甲苯浸泡2次脱蜡；梯度乙醇水化；抗原高压热修复(0.01 mol/L枸橼酸钠溶液，pH=6.0)；封闭内源性过氧化物酶(3%H2O2溶液)，室温下暗室浸泡30 min；室温下血清封闭(含5 %山羊血清的PBS溶液)30 min；加入FOXC2小鼠单克隆抗体(1 ∶100)，加入等量PBS溶液代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；加入兔抗小鼠IgG(1 ∶500)，37 ℃湿盒中孵育2 h；PBS洗涤3次，每次5 min；DAB显色10 min，自来水漂洗终止显色，苏木精染液复染胞核。

阳性结果标准：显现出边界清晰，突出于背景的棕黄色或棕褐色颗粒；每张切片100×视野随机挑选5个视野，根据每个视野阳性染色细胞比例行阳性细胞率评分(PS)。无，记为0分；1%～33%，记为1分；34%～67%，记为2分；67%～100%，记为3分。染色强度评分(IS)根据颜色由浅入深来划分(0=无色；1=浅黄色；2=棕黄色；3=棕褐色)。PS与IS相加可得总分，0～2分判断为阴性结果，3～6分判断为阳性结果[19-20]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 FOXC2 mRNA在胰腺癌组织中的表达

检索FOXC2在Oncomine中的数据，共纳入两2项研究： (1) Badea Pancreas Statistics；(2) Pei Pancreas Statistics。Badea芯片数据中共有78例样本，包括39例胰腺癌组织及对应的癌旁组织。Pei芯片数据中共有52例样本，包括36例胰腺癌组织及16例胰腺组织。分析结果显示，Badea和Pei芯片数据中胰腺癌组织FOXC2 mRNA表达量明显高于癌旁组织(t=4.074，3.741，P均<0.05)。见图1。

A：Badea胰腺癌芯片数据；B：Pei 胰腺癌芯片数据

2.2 FOXC2在胰腺癌组织中的表达

免疫组化染色结果显示，FOXC2蛋白主要表达于胰腺癌细胞胞核(图2)，且癌组织免疫组化评分明显高于癌旁组织(t=7.571，P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示，胰腺癌组织中FOXC2 mRNA的表达水平明显高于癌旁组织(t=13.79，P<0.05)，见图3。

2.3 FOXC2表达与患者临床病例资料的关系

根据免疫组化评分结果，将0～2分列入FOXC2阴性组，将3～6分列入FOXC2阳性组。统计分析结果显示，112例胰腺癌癌组织中，有84例表达为阳性(75.0%)；在癌旁组织中有26例FOXC2表达为阳性(23.2%)。FOXC2蛋白在癌组织中阳性表达率高于癌旁组织(χ2=60.1，P<0.001)。FOXC2蛋白在有淋巴结转移的癌组织中阳性表达率高于无淋巴结转移的癌组织(χ2=16.998，P<0.001)。在不同的TNM分期中，FOXC2阳性表达率差异存在统计学意义(χ2=19.193，P<0.01)；进一步两两比较显示，胰腺癌Ⅲ期FOXC2阳性表达率明显高于Ⅰ期(χ2=15.688，P<0.01)和Ⅱ期(χ2=10.678，P=0.001)。性别、年龄、分化程度、神经侵犯、脉管侵犯等对FOXC2的阳性表达率无明显影响。见表1。

2.4 FOXC2表达与患者预后的相关性

生存曲线(图4)显示，FOXC2阳性组中位生存时间较FOXC2阴性组明显缩短(P=0.001 3)，表明FOXC2阳性患者预后较FOXC2阴性者差。

Cox回归分析结果显示，FOXC2阳性表达(P=0.003)是判断胰腺癌预后的独立因素，FOXC2阳性表达患者与阴性表达患者相比，死亡风险更高(HR=2.569，95%CI：1.384～4.767)。

表1 FOXC2蛋白表达与胰腺癌患者临床资料关系

图4 FOXC2表达与患者生存时间的关系

3 讨论

本研究通过检索Oncomine数据库发现，在Badea和Pei芯片数据中FOXC2 mRNA表达在胰腺癌癌组织中均显著上调。此外，本实验结果显示FOXC2 mRNA在胰腺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织，证实FOXC2基因在胰腺癌组织中呈过表达，提示FOXC2可能与胰腺癌发展相关。

多项研究证实FOXC2表达参与恶性肿瘤的发生和转移[21-22]，此外，研究表明，FOXC2诱导肿瘤细胞上皮-间质转化，且贯穿于肿瘤侵袭和转移过程[23-25]。FOXC2与食管癌[26]、胃癌[27]、结肠癌[28]、非小细胞肺癌[29]、原发性肝细胞癌[30]以及乳腺癌[31]的预后密切相关。Watanabe等[28]研究发现，FOXC2的表达与结肠癌淋巴结的转移程度显著相关，结肠癌患者中N2期者FOXC2的表达水平较N1期者明显增加。本研究结果显示，与癌旁组织相比，癌组织中FOXC2蛋白表达明显增高，进一步证实FOXC2在胰腺癌组织中呈高表达，且FOXC2的表达水平与胰腺癌患者TNM分期、淋巴结转移相关。由此表明，FOXC2阳性表达可能与胰腺癌侵袭和转移能力相关，但尚待动物模型及细胞实验进一步验证。此外，本实验结果显示FOXC2阳性表达可作为判断胰腺癌预后的独立因素，对临床具有一定指导意义。由于本研究病理组织来自同一医院，可能存在选择偏倚，上述结果尚需多中心研究进一步证实。

综上所述，本研究证实FOXC2在胰腺癌组织中呈过表达，其参与胰腺癌肿瘤发生、发展和转移，且与胰腺癌患者预后相关。